綠僵菌發(fā)酵液滅殺粘蟲活性的研究

柳 東，高丙利，朱 振，李興林

(1. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2. 中國科學院上海生命科學研究院湖州現代農業(yè)生物技術產業(yè)創(chuàng)新中心，湖州 313000)；3. 浙江東奇生物科技有限公司，湖州 313000)

傳統(tǒng)化學農藥具有高殘留、易產生抗藥性、不易分解等特點，給人類、社會、環(huán)境等帶來了嚴重危害．生物農藥將成為解決這些問題的主要途徑之一，其開發(fā)和應用的前景已逐步受到重視．

自從 l879年梅契尼柯夫最先從奧地利金龜子上分離到金龜子綠僵菌以來，該菌已有100多年的研究歷史．綠僵菌是一類重要的生防真菌，可寄生于多種昆蟲，在生產中已得到廣泛的應用．據不完全統(tǒng)計，全世界約有 200多種昆蟲能被這種真菌感染致死[1]，該菌致病力強、效果好，對人、畜和農作物無毒害，是當前世界上研究應用最多的蟲生真菌之一．但另一方面，同細菌、病毒殺蟲劑相似，金龜子綠僵菌也存在殺蟲效果慢、受環(huán)境影響較大和效果不穩(wěn)定等缺點，因而在一定程度上限制了真菌殺蟲劑的大規(guī)模應用．

Kodaira[2]在1961年首次報道從綠僵菌中發(fā)現毒素 A、B．其后，一些結構類似物被陸續(xù)發(fā)現，但主要毒素還是DtxA、DtxB與DtxE，占培養(yǎng)物濾液毒素總量的 70%以上[3-5]．Wang Chengshu等[6]證明綠僵菌發(fā)酵液中毒素 DtxA、DtxB與 DtxE的含量與發(fā)酵液中碳氮比有關，各種毒素之間的含量也呈現出不同的相關性．本實驗通過對本實驗室保藏的 4株綠僵菌進行殺蟲效果的測試，發(fā)現其中1株在發(fā)酵液除去菌絲和孢子后仍具有較高的殺粘蟲活性．本文對此株菌株的發(fā)酵液進行室內毒力測試和高效液相色譜(HPLC)分析，為進一步開發(fā)應用該菌株及其代謝產物提供了實驗依據．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

綠僵菌(Metarhizium anisopliae)，由中國科學院上海植物生理生態(tài)研究所提供，中國科學院上海生命科學研究院湖州現代農業(yè)生物技術產業(yè)創(chuàng)新中心保藏．

1.1.2 供試蟲源

東方粘蟲(Mythimna separata)，由浙江化工研究院有限公司提供，實驗室內用玉米葉連續(xù)飼養(yǎng)和傳代，飼養(yǎng)室溫為(25±1)℃，空氣濕度為70%～80%．

1.1.3 培養(yǎng)基(g/L)

培養(yǎng)基Ⅰ：蛋白胨 30，K2HPO41，MgSO40.5，KCl 0.5，FeSO40.01，pH 6.7，121,℃滅菌 20,min．

培養(yǎng)基Ⅱ：蛋白胨 30，K2HPO41，MgSO40.5，KCl 0.5，FeSO40.01，β–丙氨酸 0.1，pH 6.7，121,℃滅菌 20,min．

培養(yǎng)基Ⅲ：蔗糖30，蛋白胨5，NaNO32，K2HPO41，MgSO40.5，KCl 0.5，FeSO40.01，pH 6.7，121,℃滅菌 20,min．

培養(yǎng)基Ⅳ：蔗糖30，蛋白胨5，NaNO32，K2HPO41，MgSO40.5，KCl 0.5，FeSO40.01，β–丙氨酸 0.1，pH 6.7，121,℃滅菌 20,min．

1.1.4 主要試劑

高效氯氰菊酯(有效成分含量為 4.5%)，南京紅太陽股份有限公司．

綠僵菌4種毒素標樣，由中國科學院上海植物生理生態(tài)研究所提供．

1.2 培養(yǎng)方法

挑取 1環(huán)平板保存的菌種，接種于 50,mL發(fā)酵培養(yǎng)基中(250,mL三角瓶)，24,℃、110,r/min培養(yǎng)7,d．

1.3 發(fā)酵濾液的制備

將初篩的菌株Ma977在24,℃、pH 6.7的條件下發(fā)酵培養(yǎng) 7,d后，先用墊有 9,cm定性濾紙的布氏漏斗抽濾，去除培養(yǎng)基和凝結的菌絲體，再將發(fā)酵濾液收集，24,℃、10,000,r/min離心 10,min，取上清液，再過 0.22,μm 的濾膜，獲得不含有菌株 Ma977菌絲或孢子的發(fā)酵濾液．分別從菌株 Ma977固體平板上挑取菌絲，在顯微鏡下觀察形態(tài)；從處理后的發(fā)酵液中吸取樣品，在顯微鏡下檢測有無菌絲或孢子存在．

1.4 室內毒力測定

采用“浸葉法”[7]測定微生物發(fā)酵液對粘蟲的胃毒活性．根據初篩和復篩的不同要求，將經過處理的發(fā)酵液配成一系列的濃度工作液，用于浸漬苗期玉米葉；每次浸漬 1片，3～5,s，每藥樣浸漬 9片，待藥液干后，放入直徑 10,cm 墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，接入 3齡幼蟲 10頭；陽性對照用高效氯氰菊酯溶液浸漬的玉米葉飼喂幼蟲，陰性對照用蒸餾水浸漬的玉米葉飼喂幼蟲．在96,h檢查結果，以粘蟲幼蟲絕對死亡為計算標準，即觸之不動者為死亡．初篩重復 3次，復篩重復 30次．同時設有陽性對照(高效氯氰菊酯溶液)、陰性對照(蒸餾水)．

1.5 HPLC分析

HPLC 分析條件：色譜分離柱為 Agilent C18(5,μm，150,mm×4.6,mm)，流動相為 V乙腈﹕V水＝60﹕40，流量 1.0,mL/min，柱溫 30,℃，進樣量 10,μL，檢測波長214,nm．

標準曲線的制作：見參考文獻[8]．

樣品處理：取 1.0,mL發(fā)酵液 10,000,r/min離心5,min，取上清液，然后用 0.22,μm 微孔濾膜過濾，所得濾液取5,μL直接進樣測定.

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵液滅殺粘蟲活性的初步篩選

以實驗室飼養(yǎng)的東方粘蟲為靶標，進行室內毒力測定．96,h后，“浸葉法”的測定結果表明，其中 1株綠僵菌的發(fā)酵液對粘蟲致死率為 100%，而其余 3株綠僵菌的發(fā)酵液對粘蟲的致死率為0%．

培養(yǎng) 96,h后的蟲體形態(tài)如圖所示，圖 1(a)為陽性對照的結果，試蟲死亡(48,h內)，蟲體干癟；圖1(b)為發(fā)酵原液的結果，試蟲死亡(96,h內)，卷曲；圖1(c)為陰性對照的結果，試蟲存活，個體肥大．

圖1 3種處理的粘蟲形態(tài)Fig.1 Three kinds of the armyworm pattern tested

2.2 發(fā)酵濾液的分析

為進一步驗證此株綠僵菌對粘蟲的致死效果，從發(fā)酵濾液、稀釋倍數、樣本數量等因素開展復篩實驗．分別在顯微鏡下觀察綠僵菌Ma977和其發(fā)酵濾液．菌株Ma977孢子和菌絲的鏡檢結果如圖2所示．

圖2 菌株Ma977孢子和菌絲Fig.2 Spores and mycelium of Ma977

圖2(a)為平板上培養(yǎng)的菌株Ma977直接制片在顯微鏡下觀察到的孢子形態(tài)，其大小一般為(4～6)μm×(2～3)μm；圖 2(b)為菌株 Ma977的菌絲形態(tài)．處理后的發(fā)酵液濾液在顯微鏡下觀察，發(fā)現所制備的發(fā)酵液濾液不含有菌絲和孢子．

2.3 發(fā)酵濾液室內毒力測試

制備菌株 Ma977發(fā)酵濾液的 1、2、4、8倍的稀釋液，設陽性對照和陰性對照，每個樣品設有 30個重復．

按照上述濃度梯度的工作液，挑選大小一致的 3齡幼蟲進行室內毒力測定，以高效氯氰菊酯溶液為陽性對照，蒸餾水為陰性對照，結果見表1．

在96,h后，陽性對照和陰性對照對粘蟲的致死率分別為 100%和 0.67%．發(fā)酵濾液原液對粘蟲的致死率為100%，稀釋2倍后對粘蟲的致死率為85.9%，表明該菌株除去菌絲和孢子的高濃度發(fā)酵濾液對粘蟲具有明顯的殺蟲效果，其發(fā)酵濾液原液的殺蟲效果與陽性對照一致；發(fā)酵濾液稀釋4倍后，對粘蟲的致死率降至10%以下，殺蟲效果明顯下降，表明發(fā)酵濾液有效成分的濃度與滅殺粘蟲的效果有顯著的相關性．

表1 不同稀釋濃度的發(fā)酵濾液對粘蟲的致死效果Tab.1 Lethal effect of different dilutions from the filtrate of the fermentation broth on Armyworm

2.4 發(fā)酵濾液殺蟲活性成分分析

依據毒素 DtxE、DtxA、DtxB2和 DtxB的相關報道[6]，在 190～1,000,nm 范圍對其標樣進行全波長掃描，結果表明，在214,nm處，這4種毒素均有較高的吸收峰．因此，HPLC分析發(fā)酵液濾液毒素成分將選用214,nm為其掃描波長．

標準品的 HPLC 分析表明，在 4.082、8.111、11.857、17.178,min處出現相應峰值(圖 3(a))，它們分別是毒素 DtxE、DtxA、DtxB2和 DtxB．Ma977菌株發(fā)酵濾液中的 HPLC結果見圖 3(b)．同標準樣相比，毒素DtxE、DtxA、DtxB2和DtxB均有出現，其峰的保留時間稍有降低，分別為3.987、7.842、11.423和16.484,min，與標準品的保留時間基本一致．由此表明，綠僵菌 Ma977的發(fā)酵液中存在毒素 DtxE、DtxA、DtxB2和DtxB．

經過多次搖瓶發(fā)酵，將濾液測試分析后，發(fā)現毒素 B2的產生非常不穩(wěn)定，其有無和含量的高低對粘蟲的致死沒有影響，產生作用效果的主要是毒素DtxE、DtxA、DtxB．

圖3 4種毒素標準品和發(fā)酵液的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC results of 4 toxin standard samples and the filtrate of fermentation broth

2.5 菌株Ma977發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.5.1 發(fā)酵時間對毒素產生的影響

培養(yǎng)時間與菌株 Ma977毒素的產生有著直接的關系．隨著接入培養(yǎng)基中孢子的萌發(fā)、菌絲的正常生長，毒素也隨著時間而逐漸產生與積累．

為了進一步確定最佳發(fā)酵時間，進行了時間對毒素產生的影響實驗．等體積接種孢子懸液于 50,mL發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅰ中(250,mL三角瓶)，于 24,℃、110,r/min振蕩培養(yǎng)，每天取樣進行HPLC分析，其結果如圖4所示．

圖4 發(fā)酵時間對毒素產生的影響Fig.4 Effect of fermentation time on toxin production

由圖 4可知，發(fā)酵的前 5,d，毒素 DtxE、DtxA、DtxB均沒有產生，到第7天時，三種毒素的含量達到最大，所以發(fā)酵時間定7,d比較合適．

2.5.2 溫度對發(fā)酵液中毒素含量的影響

菌株Ma977的最適生長溫度在24～26,℃之間，為了進一步確定最佳發(fā)酵溫度，進行了溫度對毒素產生的影響實驗．在 21、24、27、30,℃時用培養(yǎng)基Ⅰ，110,r/min振蕩培養(yǎng)7,d，考察溫度對菌株Ma977產毒素的影響，其HPLC分析結果如圖5所示．

圖5 發(fā)酵溫度對毒素產生的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on toxin production

由圖 5可以看出，較低溫度時，毒素的產生明顯受到抑制，過高溫度對毒素的產生也有不利影響，菌株Ma977發(fā)酵溫度為27,℃時比較合適．

2.5.3 初始pH對發(fā)酵液中毒素含量的影響

為了進一步確定最佳初始 pH，進行了 pH對毒素產生的影響實驗，用培養(yǎng)基Ⅰ，27,℃、110,r/min條件下振蕩培養(yǎng)7,d，其結果如圖6所示．

圖6 初始pH對發(fā)酵液中毒素含量的影響Fig.6 Effect of initial pH value on toxin content of fermentation broth

由圖6可知，當pH為3和10時，發(fā)酵7,d后，菌株Ma977沒有任何毒素產生．當pH為4時，發(fā)酵液中的毒素 DtxE、DtxA、DtxB產量達到最大．總體而言，酸性條件更有利于菌株Ma977產生毒素，最適初始pH定為4．

2.5.4 培養(yǎng)基組分對發(fā)酵液中毒素含量的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基不僅是供給菌體生長繁殖所需的能源，而且也是構成尿苷的物質來源．要積累大量的毒素，就必須要有足夠的碳源和能源．β–丙氨酸是毒素合成的必需組分，且綠僵菌自身代謝不能合成，必須依靠外界攝取．在初始 pH 為 4、27,℃、110,r/min條件下，分別在 4種培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，7,d后HPLC分析結果如圖7所示．

由圖 7可知，當發(fā)酵培養(yǎng)基選為培養(yǎng)基Ⅳ時，即察氏培養(yǎng)基中添加β–丙氨酸，可以顯著提高毒素E和A的產量，并且毒素B的含量較高．因此，發(fā)酵培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基Ⅳ．此時，毒素DtxE、DtxA、DtxB的產量達到最大，分別為 244.08,mg/L、257.18,mg/L和38.51,mg/L．

圖7 培養(yǎng)基組分對發(fā)酵液中毒素含量的影響Fig.7 Effect of medium components on toxin content of fermentation broth

3 討 論

從實驗室保藏的 4株綠僵菌中初步篩選出 1株具有殺粘蟲活性的綠僵菌菌株 Ma977，除去其菌絲和孢子后，發(fā)酵濾液的原液對粘蟲致死率可以達到100%，稀釋 2倍后，仍具有較強的殺蟲活性．此項結果具有重要的應用價值．

在國外，Wekesa 等[9]、Chandler 等[10]、Brooks等[11]、Kirkland等[12]進行了綠僵菌和白僵菌的實驗，結果均顯示綠僵菌對葉螨的防治效果較好．Pirali-Kheirabadi等[13]、Alonso-Diaz 等[14]分別進行了綠僵菌的感染實驗，其對微小牛蜱(Boophilus microplus)和具環(huán)牛蜱(Rhipicephalusannulatus)的致死率均在90%以上．在國內，許多學者對綠僵菌防治常見農林害蟲進行研究，李增智等[15]、宋漳等[16]、葉斌等[17]進行了綠僵菌對馬尾松毛蟲的感染實驗，結果顯示綠僵菌的一些菌株對馬尾松毛蟲具有毒力，且有一定的耐高溫和耐旱性．陳祝安等[18]、單樂天等[19]測定了不同來源綠僵菌對稻水象甲、云斑金龜蠐螬和桃蚜的毒力，篩選出了相應的高致病力菌株．真菌殺蟲劑劑型和相關應用技術伴隨著蟲生真菌的逐步深入研究而得到了很大的發(fā)展[20]．目前，已研制出的真菌殺蟲劑的劑型主要有：顆粒劑、乳懸液、混合劑、油劑、粉劑、干菌絲、可濕性粉劑、微膠囊和無紡布菌條等劑型．國內外研究開發(fā)的綠僵菌制劑約 10余種，其中，影響最大且最成功的范例是英國CABI Bioscience蝗蟲生物防治國際合作項目(LUBILOSA)研制的殺蝗綠僵菌生物農藥，已在非洲注冊登記、投產，大面積用于沙漠蝗的防治，成為有效的蝗蟲生防制劑．

借助接觸傳染和創(chuàng)傷傳染兩種方式，綠僵菌的孢子通過空氣、桑葉等媒體附著于蠶體表面后鉆入蠶體內寄生，形成綠僵病，如不及時防治傳染很快，死亡率較高．因此，在中國養(yǎng)蠶業(yè)較為發(fā)達的長江三角洲不適合使用傳統(tǒng)的綠僵菌產品．菌株 Ma977發(fā)酵液因不含有菌絲和孢子，對粘蟲致死效果較好，可以用于養(yǎng)蠶地區(qū)的蟲害防治，具有較好的應用開發(fā)前景．

本研究的后續(xù)工作將采用廉價的培養(yǎng)基原料，優(yōu)化此菌株的培養(yǎng)基及擴大培養(yǎng)，以顯著提高有效毒素的含量，為該菌的商業(yè)化開發(fā)提供基本參數．

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