臨床病料采集、保存、送檢及安全防護方法

周緒正 藺紅玲 李 冰 牛建榮 魏小娟 李金善李劍勇 楊亞軍 劉希望 張繼瑜*

1.國家肉牛牦牛產業(yè)技術體系疾病控制功能研究室，蘭州 730050；

2.中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所農業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室/甘肅省新獸藥工程重點實驗室，蘭州 730050

在動物檢疫及監(jiān)督的日常工作中，常會遇到一些用感官難以確診或定性的染疫動物或產品，對于這些動物或產品，需要通過實驗室檢查才能作出診斷。而一些獸醫(yī)基層單位，因技術人員知識結構的差異，往往不知道應該如何正確操作，也不懂如何自我保護。本文從病料采集前的準備、采集注意事項、常見動物病料的采集方法、病料的固定和保存、病料的送檢以及工作人員的安全防護6個方面進行系統(tǒng)闡述，供各試驗站基地、基層單位在實際工作中參考，為實現科學、健康、安全養(yǎng)殖保駕護航。

1 病料采集前的準備

首先應做好采樣計劃，如要采集足夠量的病料，還要準備采集后用具等清洗、消毒用的消毒液及容器等用品。采集病料所用的刀、剪、鑷子等用具需煮沸30min；使用前用酒精擦拭、火焰消毒；裝載的器皿經121℃高壓30min或160℃干烤2h；準備一次性針頭和注射器或真空采血管；采集一種病料，使用一套器械與容器，配制一定量的固定液和保存液。

2 采集注意事項

2.1 細菌性病料的采集

當懷疑動物或其產品為細菌感染時，為確定病菌種類，合理地采集細菌含量最多的病料是做好檢驗定性的第一步。對于活的病畜禽，應注意采集其血液、口鼻分泌物、乳汁、膿汁或局部腫脹滲出液、體腔液、尿液、生殖道分泌物和糞便等。對死亡動物采集病料時，應剝去皮膚，打開胸腹腔，以無菌操作采集病料。采集病料的種類應根據生前發(fā)病情況或所作的初步診斷有選擇地采集含菌量相應最多的臟器或內容物。

2.2 病毒性病料的采集

當初步診斷為病毒感染時，若需從動物活體上采集病料，必須在發(fā)病初期、急性期或發(fā)熱期采集；否則，病毒會很快在血液中消失，組織內病毒的含量也會因抗體的產生而迅速下降。若從死亡動物尸體上采集病料，其方法與細菌性疫病病料的采集方法基本相同。但無論是從活體還是死尸上采集病料，都既要避免污染，又要防止病毒被滅活。

2.3 死因不明動物病料的采集

對無法作出初步診斷的死因不明動物采集病料應盡量全面系統(tǒng)，或根據癥狀和病理變化有所側重。有敗血癥病理變化時，應采集血、淋巴結、心、脾、肝等；有明顯神經癥狀者，應采集腦、脊髓；有黃疸、貧血癥狀者，可采集肝、脾等。

2.4 采集過程中的注意事項

采樣所用刀、剪要銳利，切割要迅速準確，且忌拉鋸式切割，并要防止擠壓病料而造成人為變化；采集的組織標本應包含病變和其周圍較正常的組織，包含器官的重要組成部分，如腎應有皮質、髓質、腎盂等，肝、脾、肺應含有包膜；病料的大小應適宜，以利于及時而徹底地固定；死后要立即采集病料，夏季不能超過4h，若拖延過久，則組織可能發(fā)生變性、腐敗，影響檢驗結果。當懷疑為炭疽時應禁止剖檢，可在頸靜脈處切開皮膚，抽取血液作血片數張，立即送檢；排除炭疽后，方可剖檢取材。除病理組織學檢驗病料及胃腸內容物外，其他病料應無菌采集；器械及容器應事先滅菌；當采集活體病料時，如有多數動物發(fā)病，取材時應選擇癥狀和病變典型的病例，最好選擇未經抗菌素治療的病例。

3 常見動物病料的采集方法

3.1 血液的采集

1）部位。牛、羊常在頸靜脈采血，豬在耳靜脈（較大的豬）或前腔靜脈（較小的豬）采血，禽從翅靜脈采血，兔從耳靜脈或頸靜脈采血。

2）操作。采血時，先將采血部位清洗干凈，用75%的酒精消毒，待干燥后采血。對牛、羊、豬和兔采血，一般用一次性采血器或注射器，吸出后放試管內；或直接用針頭（一般用三棱針）穿刺靜脈后，將血液滴到直徑為3～4mm（可用人用的一次性輸液管）塑料管內（長度一般為5cm），將口封好，豎立存放；也可用一次性真空采血管采血。

3）保存。如需要全血樣品，在采血前應直接向采血管中加入抗凝劑，如EDTA、肝素等，最好加入肝素作為抗凝劑，采血后充分搖勻；如需用血清樣品，則不需加抗凝劑，在室溫下（不能暴曬）靜置，待血清析出，經離心機離心分離出血清，分裝。全血和血清若要長時間保存，則可置冰箱冷凍層（保存時間視冰箱的溫度），但不可反復凍融；如短時間保存，可以冷藏。

3.2 組織的采集

實質性組織，如肝臟、肺臟、脾臟、心臟、腎臟、淋巴結等，一般最好采集整個臟器。但是考慮到病料的固定和檢驗的目的性，用于微生物學檢驗的內臟組織塊不必太大，有1～2cm見方即可（如有少量污染或不能保證無污染，組織塊取大些，切割后用），將采集好的樣品置于已經消毒的容器內；若用于病理組織學檢查，則要采集病灶及臨近正常組織，并存放于10%福爾馬林溶液中固定（如作冷凍切片用，應將組織塊置于冷藏容器中，并盡快送實驗室檢驗）。采集動物的內臟組織時，如是已死亡的動物應盡快采集，夏天不應超過2h，冬天不超過6h（還要視具體溫度而定）；采集的動物病料必須新鮮，盡可能減少污染。

3.3 尿液的采集

在動物排尿時，用一次性消毒塑料杯接取。

3.4 陰道分泌物的采集

1）棉拭子法。將消毒棉拭子插入動物陰道內，然后在陰道內輕輕轉動幾下后取出，即可進行涂片鏡檢。對體型較大的動物，也可先按摩或刺激其陰部，而后再采集其陰道液。

2）刮取法。用光滑的玻璃小勺或牛角制的小刮片慢慢插入陰道內，在陰道壁輕輕刮取一點陰道分泌物，進行涂片鏡檢。

3.5 呼吸道分泌物的采集

用滅菌的棉拭子采集鼻腔、咽喉內的分泌物，蘸取后立即放入特定的保存液中（如滅菌肉湯、磷酸相加緩沖液、Hanks液等），每個棉拭子需保存液5mL。

3.6 皮膚的采集

用鋒利的外科刀刮取病變部皮膚結痂、皮屑及毛或刮取病變與健康部位交界處的皮膚組織放容器中送檢。

3.7 唾液的采集

1）直接抽取法。動物口腔或唾液腺導管抽吸唾液，此法非常簡單，但從口腔抽吸唾液會有雜質混入。

2）制造腮腺瘺法。要用外科手術方法將腮腺導管開口移向體外，即以腮腺導管為中心，切成一直徑2～3cm的圓形黏膜片，將此黏膜片與周圍組織分開，穿過皮膚切口引到頰外，將帶有導管開口的黏膜片與周圍的皮膚縫合，腮腺分泌的唾液就流出頰外，這種方法可以收集到較純凈的唾液。

3.8 胃液的采集

一般采用直接收集胃液法，先將動物麻醉，將胃管經口插入胃內，在胃管的出口連吸耳球或注射器，抽吸使胃管內形成負壓，胃液靠大氣壓順胃管流出，此法適用于牛、狗等大型動物；或者用pH7.5、35℃左右的生理鹽水灌胃，來回抽插胃管，收集流出液，進行分析。

3.9 腸內容物的采集

選病變明顯的腸道，用吸管扎穿從中吸取內容物，放入30%甘油鹽水緩沖液保存送檢；或將一段有內容物的腸管兩端扎緊，剪下送檢；另外，還可先燒灼腸漿膜，然后自該處穿破腸壁，用吸管或棉花球采取內容物檢查，或裝在消毒的廣口瓶中送檢。懷疑為中毒的動物，可采集殘余飼料、嘔吐物、胃內容物、糞便和血液等。

3.10 胰液和膽汁的采集

通過對胰總管和膽總管的插管而獲得胰液或膽汁；或者通過外科手術的方法在緊靠腸壁處切開胰管，結扎固定并與導管相連，即可見無色的胰液流入導管，采集1～2mL即可。

3.11 流產胎兒的采集

將整個胎兒放塑料袋中送檢。

3.12 腦組織的采集

開顱后取出大腦和小腦，縱切成兩半，一半放入50%甘油生理鹽水瓶中供微生物檢驗用，另一半放入10%的戊二醛溶液內供組織學檢查和電鏡檢查用。

3.13 乳汁的采集

乳房和乳房附近的毛以及術者的手，均需用消毒液洗凈消毒；將最初的幾股乳汁棄去，然后采取乳汁10～20mL于滅菌容器中。

3.14 寄生蟲病料的采集

1）蠕蟲的采集。蠕蟲卵：用漂浮法或沉淀法從糞便中收集或將活蟲置生理鹽水中，讓其產卵后收集，放入加熱到75～80℃的巴氏液（40%甲醛溶液30mL，氯化鈉75g，水1000mL）中保存；也可用含有40%甲醛溶液10mL、95%乙醇30mL、甘油40mL、蒸餾水56mL的混合液保存。大型蠕蟲（如蛔蟲）：用彎頭針、毛筆將蟲體收集在生理鹽水中，洗除蟲體上的糞便、黏液，然后保存于70%乙醇或4%甲醛中（固定液加熱到70℃左右，再投入蟲體，使蟲體在熱固定液中伸直而固定）。絳蟲：如頭節(jié)還吸附于腸壁上，為了保證蟲體的完整，切勿用力猛拉，而應將附著有蟲體的腸段剪下，連同蟲體浸入生理鹽水中5～6h后，頭節(jié)會自行脫落，體節(jié)也自行伸直。細小蠕蟲（如線蟲）：用分離針等小心從胃腸內容物中挑出，放入盛有生理鹽水的小試管內，塞緊，充分振蕩，將污物洗凈，然后放入煮沸的5%甘油酒精中，使蟲體伸展保存。

2）蜘蛛、昆蟲的采集?？蓮膭游矬w表或外界環(huán)境中采集。保存蜘蛛類（蜱、螨等）可將其投入開水中片刻，然后保存于70%乙醇內（最好加入5%的甘油）。細小昆蟲（如螨和虱蠓等）個體較小，常需刮取皮屑，可直接用70%酒精保存。

3）原蟲的采集。血液內原蟲可制成血片用甲醇固定，各片間用硬紙片隔開，用線扎緊；也可采用抗凝血迅速送檢。組織內原蟲一般在死后剖檢時，取一小塊組織，做成抹片或組織切片送檢。糞便內原蟲（球蟲），一般情況下采集新排出的糞便，按蠕蟲蟲卵收集方法進行卵囊收集。保存卵囊是保存球蟲最常用的方法，在收集到的卵囊中加入2.5%重鉻酸鉀，置室溫中待其孢子形成，孢子形成后的卵囊可在5～20℃的常溫下保存1a。

4 病料的固定和保存

實質性器官的病料存放在消毒過的容器內。若用于病理組織學檢查，存放于10%福爾馬林溶液或10%的戊二醛溶液中（如作冷凍切片用，應將組織塊放在冷藏容器中，并盡快送實驗室檢驗）；短時間內不能送到的病料，上面加滅菌石蠟油2～3cm，用蠟封固，置于裝有冰塊的冰瓶中迅速送檢（沒有冰塊時，可在冰瓶中加冷水，并加入等量硫酸銨，可使水溫冷至零下，將裝病料的小瓶浸入此液中送檢）；夏天在運輸時間長時，要勤換固定液。亦可將病料浸入保存液中，供微生物學檢查的液體病料，需包扎牢靠，以防止外溢污染、變質；供血清學檢查的血清裝入滅菌小瓶內。細菌性病料可用飽和鹽水或30%甘油緩沖液，病毒性病料可浸于50%甘油緩沖液中。進行微生物學檢驗的病料，若病料不能立即送檢，最佳的保存方法應為冷凍或冷藏。

5 病料的送檢

要求送檢人員應對動物的整個發(fā)病情況十分了解或有詳實的記錄，最好是現場技術人員親自送檢，以便提供畜群發(fā)病過程的全部信息，對實驗室診斷十分重要。禁止送檢死亡過久或腐敗變質的病料，這種病料對診斷毫無意義，而且還拖延了診斷時間，對疾病的及時有效控制極為不利。微生物檢驗用病料，盡可能專人送檢；送檢時，除注意冷藏保存外，還需將病料妥為包裝，避免破損散毒。用冰瓶送檢時，裝病料的瓶子不宜過大，并在其外包一層棉花，途中要避免振動、沖撞，以免碰破冰瓶。若系郵寄送檢，應將病料于固定液中固定24～48h后取出，用浸有同種固定液的脫脂棉包好，裝在塑料袋中，放在木盒內郵寄；郵寄標本同時，應附上尸體剖檢記錄等有關材料一份，填寫送檢動物組織種類、數量、檢驗目的、病料所用固定液種類、送檢時間、送檢單位和送檢人及通信地址。每種病料都要附以標鑒，并復寫送檢單一式3份，1份存查，2份寄往檢驗單位，檢驗完畢后退回1份。

6 工作人員的安全防護

人畜共患病嚴重影響人類（特別是與畜禽密切接觸者）的健康及生命安全。世界上已發(fā)現的人畜共患病有200多種，經常流行、危害嚴重的有30多種，如瘋牛病、炭疽、豬鏈球菌病、結核病、豬囊尾蚴病、牛囊尾蚴病、旋毛蟲病、弓形蟲病、鉤端螺旋體病、沙門菌病、血吸蟲病、狂犬病、高致病性禽流感、鼠疫等。獸醫(yī)工作人員尤其是病料采集人員由于頻繁接觸患病動物，所以是人畜共患病的高危人群，因此，應警惕人畜共患病對自身的感染。鑒于上述原因，工作人員在采集病料時應該注意以下幾點：第一，注意飲食衛(wèi)生，禁止食用死亡的動物。第二，如果條件允許，可以接種疫苗。接種疫苗的主要目的是降低感染普通傳染病的幾率。第三，工作人員在采集病料時更應注意個人衛(wèi)生，工作時戴口罩、穿工作服（防護服）、戴手套，接觸患畜或其糞便等污染物后要勤洗手，并保持工作環(huán)境中空氣流通。第四，工作人員應該對動物糞便作及時處理，注意圈舍的消毒。

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