金櫻子鞣質(zhì)含量測定及其抗氧化提高生育力的實驗研究

林芳花，彭永宏，沈翠霞，柴素芬

金櫻子(Rosa laevigata Michx.)為薔薇科植物，以成熟果實入藥，味酸、甘、澀、平，具有固精縮尿，固崩止帶，澀腸止瀉的功能［1］，為藥食同源植物，分布廣，療效顯著，價廉易得，民間常用于補腎壯陽、治療不孕不育癥和日常保健強(qiáng)身。鞣質(zhì)是多元酚類化合物，是植物次生代謝產(chǎn)物，具有收斂性，內(nèi)服可治胃腸道出血、水瀉等癥，被認(rèn)為是良好的天然抗氧化劑［2］。因此，本課題組擬對金櫻子進(jìn)行鞣質(zhì)含量的測定、抗氧化活性和對果蠅生育能力影響的實驗研究，為綜合開發(fā)金櫻子資源提供參考。

1 材料

1.1 藥材及藥品 金櫻子于2010年11月采自河源南天中醫(yī)藥文化產(chǎn)業(yè)有限公司金櫻子種植基地，經(jīng)惠州學(xué)院生命科學(xué)系柴素芬副教授鑒定為薔薇科植物金櫻子(Rosa laevigata Michx.)。采摘后于烘箱中50℃干燥，粉碎，備用。果蠅于2010年10月購自中山大學(xué)，為美國野生型黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)。維生素C(Vc)購自天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純，批號為2010－12－23。

1.2 試劑 玉米粉、蔗糖、酵母購于惠州市惠城區(qū)沃爾瑪超市，干酪素為化學(xué)純，瓊脂粉為生化試劑，其余試劑均為分析純。

1.3 器材 電子天平(上海精天電子儀器有限公司，精度0.1 mg)、超聲波清洗儀(東莞市三源超聲波設(shè)備有限公司)、紫外－可見分光光度計(日本島津公司UV－2450)、微電腦光照培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司SPX－300B－G)、電熱恒溫干燥箱(上海實驗儀器廠 PH050)、中藥粉碎機(jī)(溫嶺市大德中藥機(jī)械有限公司DF－20)。

2 方法

2.1 金櫻子不同部位鞣質(zhì)含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸50 mg，置100 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密量取5 mL，置50 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對照品溶液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，分別置25 mL棕色量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試液1 mL，再分別加水 11.5 mL、11.0 mL、10.0 mL、9.0 mL、8.0 mL、7.0 mL，用10% 碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外－可見分光光度法(附錄X A)，在760 nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.3 供試品溶液的制備 分別取金櫻子根、莖、葉、果實粉末各0.5 g，精密稱定，分別置100 mL棕色量瓶中，加水60 mL，放置過夜，超聲處理10 min，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，靜置，濾過，棄去初濾液30 mL，精密量取續(xù)濾液20 mL，置100 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 供試品鞣質(zhì)含量測定 按照《中國藥典》2010年版一部(附錄X B)鞣質(zhì)含量測定法進(jìn)行。

2.2 金櫻子不同部位體外抗氧化活性

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取 Vc粉末0.05 g，置50 mL錐形瓶中，加入10 mL50% 乙醇，攪拌至溶解，置50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取金櫻子根、莖、葉、果實粉末各1 g，精密稱定，置50 mL錐形瓶中，加入10 mL 50% 乙醇，靜置30 min，超聲提取30 min，過濾，濾液置100 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.2.3 氧化時間的測定 按照《中國藥典》2010年版一部336頁蜂膠項下方法進(jìn)行。

2.2.4 超氧陰離子清除率的測定 按照文獻(xiàn)［3］采用光照核黃素產(chǎn)生超氧陰離子自由基的方法測定。2.2.5還原力的測定 按照文獻(xiàn)［4］采用普魯士藍(lán)法測定。

2.3 金櫻子根對果蠅生育能力的影響

2.3.1 供試品溶液的制備 取金櫻子根粉末5 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，加入50 mL水，放置過夜，次日超聲提取30 min，過濾，備用。

2.3.2 果蠅培養(yǎng)基的配制 取700 mL水放入鍋中，加入瓊脂粉8 g，邊加熱邊攪拌直至水沸騰，加入白糖40 g，再加入玉米糊65 g(先溶入200 mL冷水中調(diào)成糊狀)，繼續(xù)煮約8 min，停止加熱，加入丙酸，攪拌，降溫至50℃左右，加入酵母粉8 g，分裝培養(yǎng)瓶，即得基本培養(yǎng)基。自加入酵母粉8 g起，分別加入供試品溶液，使培養(yǎng)基中含金櫻子根生藥濃度分別為2.0%、4.0%、8.0%，分裝培養(yǎng)瓶，即得供試品培養(yǎng)基。

2.3.3 果蠅生育力的測定 收集同一批10 h內(nèi)新羽化果蠅，乙醚麻醉后分雌雄，在基本培養(yǎng)基中飼養(yǎng)2周后，隨機(jī)分成4組，每組10瓶，每瓶一對雌雄，其中3組置供試品培養(yǎng)基中飼養(yǎng)，1組置基本培養(yǎng)基中飼養(yǎng)作為對照組，7 d后去掉親本，繼續(xù)培養(yǎng)，每天定時觀察，從第一只果蠅成蟲出現(xiàn)開始計數(shù)，直至全部羽化，計錄各組每瓶子一代(F1)和子二代(F2)果蠅數(shù)量。

2.3.4 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間樣本均數(shù)比較用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，全部數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 金櫻子不同部位鞣質(zhì)含量測定結(jié)果 金櫻子不同部位均含有鞣質(zhì)，含量由高到低依次為葉、根、莖、果實，結(jié)果見表1。

表1 金櫻子不同部位鞣質(zhì)含量測定結(jié)果，n=3)

表1 金櫻子不同部位鞣質(zhì)含量測定結(jié)果，n=3)

樣 品 鞣質(zhì)含量(%)5.33莖2.00葉6.52果實根1.83

3.2 金櫻子不同部位體外抗氧化活性結(jié)果 氧化時間越短，表明抗氧化能力越強(qiáng)，《中國藥典》蜂膠項下規(guī)定的氧化時間(不得過22 s)。金櫻子各部位氧化時間由短到長依次為根、葉、果實、莖，其中，根和葉的氧化時間短于Vc。在總還原力測定中，吸光度越大表明抗氧化能力越強(qiáng)，金櫻子根和葉的吸光度與Vc相近，而莖和果實的吸光度低于Vc。超氧陰離子清除率越大表明抗氧化能力越強(qiáng)，金櫻子根、莖、葉超氧陰離子清除率均高于Vc，果實超氧陰離子清除率雖然低于Vc但也達(dá)到34.60%。上述結(jié)果表明金櫻子根、莖、葉和果實均有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，結(jié)果見表2。

表2 金櫻子不同部位體外抗氧化活性結(jié)果，n=3)

表2 金櫻子不同部位體外抗氧化活性結(jié)果，n=3)

樣 品 氧化時間(s) 超氧陰離子清除率(%) 吸光度(A)7.8 ± 0.9 49.71 0.667 ± 0.013莖 31.1 ± 0.1 55.46 0.357 ± 0.012葉 10.3 ± 0.9 52.53 0.668 ± 0.008果實 28.9 ± 1.1 52.05 0.540 ± 0.018根Vc 15.8 ± 0.6 45.03 0.690 ± 0.007

3.3 金櫻子根對果蠅生育力的影響結(jié)果 金櫻子根能增加果蠅交配后產(chǎn)生的F1和F2數(shù)量，且與劑量存在正相關(guān)性，具有提高果蠅的生育力的作用。與對照組相比，4.0%和8.0%濃度組能顯著增加果蠅F1數(shù)量，增殖率分別為 44.62%和 65.64%;4.0%濃度組對果蠅F2增殖率達(dá)到138.67%，非常顯著地增加果蠅F2數(shù)量，2.0%組和8.0%組亦顯著提高果蠅 F2數(shù)量，增殖率分別為68.23%和71.82%，結(jié)果見表3和表4。

4 小結(jié)

生物氧化是指在生物體內(nèi)代謝物脫下的氫及電子，通過一系列酶促反應(yīng)與氧結(jié)合生成水，并釋放能量維持機(jī)體正常生理功能的過程。

表3 金櫻子根對果蠅F1數(shù)量的影響，n=10)

表3 金櫻子根對果蠅F1數(shù)量的影響，n=10)

金櫻子根濃度(%)產(chǎn)果蠅總數(shù)(只)平均每對產(chǎn)果蠅數(shù) (只) F1增殖率 (%)0.0 195 21.7 ± 2.1 －2.0 235 26.1 ± 2.2 20.51 4.0 282 40.2 ± 2.4* 44.62 8.0 323 40.4 ± 2.5*65.64

表4 金櫻子根對果蠅F2數(shù)量的影響，n=10)

表4 金櫻子根對果蠅F2數(shù)量的影響，n=10)

注:增殖率=(實驗組羽化果蠅數(shù)－對照組羽化果蠅數(shù))/對照組羽化果蠅數(shù)×100%與對照組比較，*:p＜0.05，＊＊:p＜0.01

金櫻子根濃度(%)產(chǎn)果蠅總數(shù)(只)平均每對產(chǎn)果蠅數(shù)(只) 增殖率(%)71.82 0.0 362 40.2 ±2.9 －2.0 609 60.9 ±3.1* 68.23 4.0 864 86.4 ±4.1＊＊ 138.67 8.0 622 62.2 ±3.0*

生物氧化過程伴隨產(chǎn)生自由基，過量的自由基對機(jī)體是有害的，可攻擊細(xì)胞內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類、有機(jī)酸等生物分子，人類許多重大疾病如動脈粥樣硬化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、癌癥、生殖發(fā)育、衰老均與自由基造成的氧化損傷有關(guān)。天然植物包括蔬菜、水果、谷物及中草藥等都含有黃酮、多酚、鞣質(zhì)、皂苷及生物堿等抗氧化活性成分，從資源豐富的天然植物中研究與開發(fā)抗氧化活性物質(zhì)成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點［2］。

歷代醫(yī)書記載金櫻子常以果實和根入藥，具有固精攝精、縮尿、止瀉、止帶的作用。鞣質(zhì)是植物多酚類化合物，是植物次生代謝物，是人及動物重要的抗氧化功能因子。本實驗研究結(jié)果表明金櫻子根、莖、葉、果實均含有鞣質(zhì)，尤以根和葉的含量豐富，均有不同程度抗氧化活性;金櫻子根能顯著提高果蠅的生育力，提示我們金櫻子根、莖、葉、果實均可以作為抗氧化功能活性因子研究與開發(fā)的材料。由于時間有限，本文僅就金櫻子根、莖、葉、果實鞣質(zhì)含量和體外抗氧化活性，金櫻子根對果蠅的繁殖力的影響進(jìn)行初步研究，希望能夠為尋找金櫻子抗氧化、延緩衰老、提高生育力等保健功能因子的研究與開發(fā)提供參考。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

［2］ 鄭榮梁，黃中洋.自由基生物學(xué)［M］.北京:高等教育出版社，2007.

［3］ 施躍堅，陳海云.絞股藍(lán)體外抗活性氧自由基的研究［J］.云南民族大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2008，(3):241－243.

［4］ 徐亞民，馬越，趙曉燕.紫蘇等4種天然色素抗氧化能力的比較［J］.華北農(nóng)學(xué)報，2007，22(2):187 －190.