軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白1誘導(dǎo)瘢痕成纖維細(xì)胞表達(dá)軟骨表型的實驗研究

馬曉飛 張艷 柴崗 朱明

體內(nèi)廣泛分布的真皮成纖維細(xì)胞（DFs）與軟骨細(xì)胞都來源于中胚層間質(zhì)細(xì)胞，與軟骨細(xì)胞不同的是，DFs保留了中胚層間質(zhì)細(xì)胞增殖力強(qiáng)的特性，多次傳代后仍能保持強(qiáng)大的增殖力[1]。以往認(rèn)為DFs屬于終末分化細(xì)胞，只能構(gòu)建真皮組織，不能向其他組織細(xì)胞分化。近來研究發(fā)現(xiàn)，DFs中存在間充質(zhì)干細(xì)胞，具有向軟骨、骨、脂肪、神經(jīng)等組織分化的潛能[2-4]。研究發(fā)現(xiàn)，在CDMP1作用下，DFs可向軟骨細(xì)胞分化并表達(dá)軟骨特異性基質(zhì)[5-6]。Zhao等[7]進(jìn)一步利用犬DFs進(jìn)行半月板的自體構(gòu)建，并成功修復(fù)了犬半月板缺損。臨床上大面積燒傷及頭頸部燒傷患者常伴有耳軟骨的燒傷缺損，切取自體肋軟骨進(jìn)行耳重建創(chuàng)傷較大。DFs的軟骨分化潛能為耳缺損的重建提供了一條新途徑。但是，大面積燒傷患者皮源緊張，無多余皮膚可取，切取正常皮膚亦會增加感染風(fēng)險，這在一定程度上限制了DFs作為軟骨構(gòu)建種子細(xì)胞的進(jìn)一步研究和應(yīng)用。文獻(xiàn)證明，瘢痕成纖維細(xì)胞同樣具有強(qiáng)大的體外增殖能力及基質(zhì)分泌能力，能夠分泌大量膠原及蛋白聚糖，而后者是構(gòu)成軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分[8-9]。研究表明，瘢痕成纖維細(xì)胞具有部分干細(xì)胞的特性，在特定條件下能夠表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物，并能夠向其他組織細(xì)胞轉(zhuǎn)化，具有類似于DFs樣的分化潛能[10-11]。

因此，本實驗利用CDMP1為誘導(dǎo)因子，探索瘢痕成纖維細(xì)胞的軟骨誘導(dǎo)分化潛能，評價其作為軟骨種子細(xì)胞的可行性，為瘢痕成纖維細(xì)胞用于燒傷后耳軟骨缺損的修復(fù)進(jìn)行初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

CDMP1（Research Diagnostics公司，美國）；Ⅰ型膠原酶（Worthington公司，美國）；DMEM培養(yǎng)液（Gibco 公司，美國）；鼠抗 ColⅠ、ColⅡ、Sox9、Aggrecan抗體（Chemicon公司，美國）；FITC兔抗鼠IgG(Oncogene 公司，美國)；Hoechst(1:500，Sigma 公司，美國)；Trizol(Invitrogen公司，美國)；RT-PCR試劑盒（TaKaRa公司，日本）；封閉緩沖液、鏈抗生物素球蛋白-堿性磷酸酶（Pierce公司，美國）。

恒溫CO2培養(yǎng)箱（Forma公司，美國）；普通臺式離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī)（Heraeus公司，美國）；倒置相差顯微鏡(Nikon公司，日本)；超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；電泳儀(天能科技有限公司)；熱循環(huán)儀(Biometra公司，美國)；DU2-640紫外分光光度計、流式細(xì)胞儀（Beckman公司，美國）；100 mm培養(yǎng)皿、離心管（FALCON Franklin LakesNT公司，美國）。

1.2 取材與細(xì)胞培養(yǎng)

取上海第九人民醫(yī)院整復(fù)外科手術(shù)切除的廢棄瘢痕組織，超凈臺內(nèi)去除表皮及皮下組織，剩余瘢痕增生部分剪碎移入離心管，加入10倍于組織體積的0.3%的Ⅰ型膠原酶，37℃、3 h、100目細(xì)胞濾器過濾后離心，2000 r/min，10min，棄上清，加入 10%FBS的DMEM培養(yǎng)液混浴，接種至100 mm的培養(yǎng)皿。待細(xì)胞融合至80%時，以1×104cells/cm2密度傳代，體外擴(kuò)增至第4代進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞誘導(dǎo)及分組

配制CDMP1誘導(dǎo)液（2%胎牛血清F-12培養(yǎng)液，CDMP1終濃度為100 ng/mL）。取第4代瘢痕成纖維細(xì)胞，無血清培養(yǎng)液孵育24h后更換為誘導(dǎo)液，每3天換液一次，誘導(dǎo)7 d；陰性對照組加入含2%FBS的F-12培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)；取上海第九人民醫(yī)院整復(fù)外科患者肋軟骨切除術(shù)后部分軟骨組織，分離軟骨細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，作為陽性對照組。

1.4 形態(tài)觀察

倒置顯微鏡觀察誘導(dǎo)前后細(xì)胞形態(tài)，Image Plus軟件分析誘導(dǎo)前后細(xì)胞長徑與短徑，計算細(xì)胞長寬比例。

1.5 免疫熒光檢測

細(xì)胞誘導(dǎo)7 d后，4%多聚甲醛固定10min，PBS漂洗，Triton破膜15min，10%羊血清封閉30min，加入鼠抗 ColⅠ、ColⅡ、Sox9、Aggrecan 抗體，4 ℃過夜，PBS漂洗，F(xiàn)ITC兔抗鼠IgG孵育30min，PBS漂洗，Hoechst（1:500）染核 2～5min，PBS 漂洗后封片，熒光顯微鏡觀察，胞漿內(nèi)綠色熒光為陽性表達(dá)，胞核為藍(lán)色熒光。

1.6 RT-PCR檢測

Trizol提取對照組和實驗組總mRNA，檢測ColⅠ（F-tgttcagctttgtggacctc，R-cttggtctcgtcacagatca；236 bp）、ColⅡ （F-cttgggcacctcgggctcctttag， R-tccccggcactcctggcactgat；510 bp）、Sox9（F-gaacgcacatcaagacggag，R-tctcgttgatttcgctgctc；631 bp）、Aggrecan（F-tcctggaagctcttctcact，R-atgcccaagactaccagtgg；510 bp）的表達(dá)，以β-actin（318 bp）作為內(nèi)參照。根據(jù)RTPCR試劑盒操作說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件：94℃變性，55℃退火，35個循環(huán)。

1.7 Western blot檢測

收集誘導(dǎo)7 d后的細(xì)胞，提取總蛋白。加入等體積2倍的十二烷基硫酸鈉（SDS）上樣緩沖液，β-硫基乙醇 2μL/100μL。 100 ℃沸水變性 10min，冷卻至室溫上樣。聚丙烯酰胺凝膠電泳10 mA，3～4h。電泳結(jié)束后90 V、4℃轉(zhuǎn)膜2 h，4℃封閉過夜。37℃依次加入鼠抗一抗（1:500）生物素化二抗 IgG（1∶500）、鏈抗生物素球蛋白-堿性磷酸酶（1∶3400）進(jìn)行雜交，逐級雜交放大后滴加顯色底物，顯色后進(jìn)行結(jié)果分析。

1.8 Micromass法誘導(dǎo)與檢測

取第3代瘢痕成纖維細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞至密度為5×107cells/mL，以每滴 15μL 滴至培養(yǎng)皿底部，37 ℃、95%CO2、5%O2培養(yǎng)箱內(nèi)放置2 h，加入誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)及對照組處理同上。誘導(dǎo)7 d后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色和Safranine-O染色，檢測ColⅡ及軟骨基質(zhì)的表達(dá)[12]。

1.9 統(tǒng)計分析

利用 SPSS 11.0 軟件（Chicago，IL）對組間數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗，P<0.05認(rèn)為差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞誘導(dǎo)前后形態(tài)變化

誘導(dǎo)前瘢痕成纖維細(xì)胞為長梭形，誘導(dǎo)后長梭形的瘢痕成纖維細(xì)胞開始向多角形，不規(guī)則形轉(zhuǎn)變，與軟骨形態(tài)類似。對照組未見明顯變化（圖1）。Image Plus軟件分析顯示，誘導(dǎo)后細(xì)胞長寬比例為（1.48±0.21）:1，與誘導(dǎo)前的（7.21±1.54）:1 相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與正常軟骨細(xì)胞的（1.31±0.13）:1 相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（圖 2）。

2.2 免疫熒光檢測

熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，單層培養(yǎng)的瘢痕成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)后表達(dá)ColⅡ、Sox9和Aggrecan，熒光強(qiáng)度較正常軟骨細(xì)胞稍弱；未誘導(dǎo)瘢痕成纖維細(xì)胞未見ColⅡ、Sox9和Aggrecan表達(dá)。誘導(dǎo)前后瘢痕成纖維細(xì)胞均表達(dá)ColⅠ，誘導(dǎo)后熒光強(qiáng)度較誘導(dǎo)前稍弱，軟骨細(xì)胞未見ColⅠ表達(dá)（圖3）。

2.3 RT-PCR檢測

CDMP1誘導(dǎo)7 d后，RT-PCR檢測到 ColⅡ、Sox9和Aggrecan擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增結(jié)果與正常軟骨細(xì)胞相一致；未誘導(dǎo)組未見ColⅡ和Sox9軟骨相關(guān)標(biāo)志物的擴(kuò)增結(jié)果，Aggrecan檢測到少量擴(kuò)增產(chǎn)物；誘導(dǎo)組與未誘導(dǎo)組均出現(xiàn)ColⅠ擴(kuò)增產(chǎn)物，正常軟骨細(xì)胞未檢測到ColⅠ擴(kuò)增產(chǎn)物（圖4）。

2.4 Western blot檢測

瘢痕成纖維細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)7 d后，Western blot結(jié)果顯示ColⅡ、Sox9和Aggrecan等軟骨特異蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)后結(jié)果與正常軟骨細(xì)胞相一致，未誘導(dǎo)組未見ColⅡ和Sox9特異蛋白表達(dá)，Aggrecan弱表達(dá)。誘導(dǎo)組與未誘導(dǎo)組均出現(xiàn)ColⅠ表達(dá)，正常軟骨細(xì)胞未檢測到ColⅠ表達(dá)（圖5）。

2.5 Micromass培養(yǎng)法誘導(dǎo)前后比較

將瘢痕成纖維細(xì)胞進(jìn)行Micromass誘導(dǎo)7 d。HE染色顯示整個細(xì)胞團(tuán)塊以纖維性組織為主，團(tuán)塊外緣部分細(xì)胞出現(xiàn)特征性軟骨陷窩。免疫組織化學(xué)檢測ColⅡ表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Micromass團(tuán)塊部分區(qū)域出現(xiàn)黃褐色，提示Ⅱ型膠原的表達(dá)。Safranine-O染色結(jié)果顯示細(xì)胞團(tuán)塊大部分區(qū)域出現(xiàn)紅染，外側(cè)顏色深于中央，提示有軟骨基質(zhì)的沉積（圖6）。

圖1 各組細(xì)胞組織學(xué)觀察（倒置相差顯微鏡，100×）Fig.1 The histological observation(Inverted phase contrast microscope,100×)

圖2 各組細(xì)胞長寬比例Fig.2 Cell length/width ratio in each group

圖3 免疫熒光檢測各組細(xì)胞ColⅠ、ColⅡ、Sox9及Aggrecan的表達(dá)（免疫熒光顯微鏡，100×）Fig.3 The expression of ColⅠ,colⅡ,Sox9 and Aggrecan of each group detected by immunofluorescence(Immunofluorescence Microscopy,100×)

圖4 RT-PCR檢測各組細(xì)胞ColⅠ、ColⅡ、Sox9及Aggrecan的表達(dá)Fig.4 The expression of ColⅠ,colⅡ,Sox9 and Aggrecan of each group detected by RT-PCR

圖5 Western blot檢測各組細(xì)胞 ColⅠ、ColⅡ、Sox9 及Aggrecan的表達(dá)Fig.5 The expression of ColⅠ,colⅡ,Sox9 and Aggrecan of each group detected by Western blot

圖6 Micromass誘導(dǎo)7 d后各組HE染色、免疫組織化學(xué)染色及Safranine-O染色結(jié)果Fig.6 The histological observation of each group after 7 days micromass culture by HE staining,immunohistochemistry and Safranine-O staining

3 討論

軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Cartilage-derived morphogenetic protein 1，CDMP1）[13]是骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）家族中的一類特異性生長因子，是與軟骨形態(tài)發(fā)生和發(fā)育最為相關(guān)的一類生長因子。CDMP1主要通過調(diào)節(jié)間質(zhì)前體細(xì)胞的分化，參與正常軟骨組織的生長，并促進(jìn)軟骨損傷的修復(fù)過程，在軟骨的分化發(fā)育中起重要調(diào)控作用。研究表明，CDMP1能夠誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨表型分化，并表達(dá)特異性軟骨基質(zhì)[14]，是干細(xì)胞定向譜系分化的一種高效誘導(dǎo)劑。

真皮成纖維細(xì)胞與軟骨細(xì)胞都來源于中胚層間質(zhì)細(xì)胞。與軟骨細(xì)胞不同的是，DFs保留了中胚層間質(zhì)細(xì)胞增殖力強(qiáng)的特性，多次傳代后仍能保持強(qiáng)大的增殖力，是體內(nèi)最大的“種子庫”。研究表明，DFs并非完全分化的終末體細(xì)胞，在特定條件下仍具有向其他譜系細(xì)胞分化的能力。Han等[15]采用基因轉(zhuǎn)染的方法將4種基因轉(zhuǎn)入牛的DFs，轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)DFs具有干細(xì)胞的多向分化潛能，能夠向骨、脂肪、軟骨、神經(jīng)等多類型組織細(xì)胞分化。Kunihiko等[16]取鼠DFs采用基因轉(zhuǎn)染后進(jìn)行軟骨定向誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)DFs即使在未轉(zhuǎn)變?yōu)镮PS細(xì)胞的前提下仍能夠向軟骨細(xì)胞分化，并表達(dá)軟骨特異標(biāo)志物，推測DFs本身可能具有干細(xì)胞潛能。CDMP1可直接誘導(dǎo)DFs向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并能夠在體內(nèi)成功構(gòu)建半月板軟骨，實現(xiàn)半月板的生物修復(fù)，證明了DFs具有軟骨分化潛能。

病理性瘢痕的形成是成纖維細(xì)胞過度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積的過程。在一系列細(xì)胞生長因子的調(diào)控下，瘢痕成纖維細(xì)胞增殖力活躍，基質(zhì)分泌能力旺盛，大量合成膠原及蛋白聚糖等物質(zhì)，導(dǎo)致瘢痕過度增生。相對于DFs而言，瘢痕成纖維細(xì)胞保持了體外培養(yǎng)的高度增殖力，并具有比DFs更強(qiáng)大的分泌能力，能夠分泌軟骨特異性標(biāo)志物Aggrecan。特別是對于大面積燒傷伴有耳軟骨缺損患者，因皮源緊張導(dǎo)致無皮可取，瘢痕成纖維細(xì)胞成為DFs的最佳替代種子細(xì)胞。研究表明，瘢痕成纖維細(xì)胞不僅具有強(qiáng)大的增殖力，同時具有間充質(zhì)干細(xì)胞的活性，在特定條件下可能具有向其他譜系細(xì)胞分化的潛能。Yang等[10]提取瘢痕疙瘩中的成纖維細(xì)胞，在特定誘導(dǎo)條件下發(fā)現(xiàn)瘢痕成纖維細(xì)胞具有干細(xì)胞樣分化潛能，能夠表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物，并能夠向神經(jīng)細(xì)胞分化誘導(dǎo)，有望成為一種潛在的組織修復(fù)種子細(xì)胞。Moon等[11]從頭皮瘢痕中分離瘢痕成纖維細(xì)胞，采用各種誘導(dǎo)體系對瘢痕成纖維細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，結(jié)果顯示瘢痕成纖維細(xì)胞能夠表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志物 CD13、CD29、CD44、CD90、Fibronectin及Vimentin等，并能夠向骨組織細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌腱細(xì)胞及上皮細(xì)胞等方向分化；在向神經(jīng)組織分化過程中，瘢痕成纖維細(xì)胞在誘導(dǎo)后具有神經(jīng)干細(xì)胞的特性，表達(dá)神經(jīng)元干細(xì)胞的標(biāo)志物，并向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化，證明了瘢痕成纖維細(xì)胞具有多向分化潛能，可能成為多組織修復(fù)的替代細(xì)胞。ColⅡ和Aggrecan是目前已證明的軟骨細(xì)胞最特異的標(biāo)記物[17]，瘢痕成纖維細(xì)胞本身并不表達(dá)ColⅡ。在本實驗的誘導(dǎo)體系下，單層培養(yǎng)的瘢痕成纖維細(xì)胞經(jīng)CDMP1誘導(dǎo)7 d后，細(xì)胞形態(tài)由長梭形向多角形轉(zhuǎn)變，細(xì)胞長寬比例降低，與軟骨細(xì)胞差異無統(tǒng)計意義。免疫熒光、RT-PCR、Western blot等均證實誘導(dǎo)后的瘢痕成纖維細(xì)胞表達(dá)ColⅡ，且誘導(dǎo)后瘢痕成纖維細(xì)胞Aggrecan表達(dá)增強(qiáng)，證實瘢痕成纖維細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。同時，誘導(dǎo)后瘢痕成纖維細(xì)胞出現(xiàn)Sox9的表達(dá)，Sox9是調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞分化與軟骨基質(zhì)合成的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，提示CDMP1可能通過調(diào)控上述基因的作用誘導(dǎo)瘢痕成纖維細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。為進(jìn)一步證實上述研究結(jié)果，我們又將瘢痕成纖維細(xì)胞進(jìn)行Micromass法培養(yǎng)誘導(dǎo)，誘導(dǎo)7 d后發(fā)現(xiàn)，Micromass團(tuán)塊部分瘢痕成纖維細(xì)胞出現(xiàn)軟骨陷窩結(jié)構(gòu)，由于團(tuán)塊外側(cè)對于培養(yǎng)液接觸的優(yōu)勢性，因此出現(xiàn)軟骨陷窩結(jié)構(gòu)的瘢痕成纖維細(xì)胞多聚集在外側(cè)。免疫組織化學(xué)染色顯示，細(xì)胞團(tuán)塊偏外側(cè)區(qū)域出現(xiàn)黃褐色顯色，表明瘢痕成纖維細(xì)胞ColⅡ的表達(dá)，顯色區(qū)域與出現(xiàn)軟骨陷窩結(jié)構(gòu)區(qū)域基本一致。Safranine-O染色示細(xì)胞團(tuán)塊出現(xiàn)大片紅染，表明瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)外有軟骨基質(zhì)的沉積，進(jìn)一步證實了瘢痕成纖維細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化潛能。

本實驗證明，在CDMP1誘導(dǎo)下，瘢痕成纖維細(xì)胞在單層培養(yǎng)和Micromass培養(yǎng)條件下，均能向軟骨細(xì)胞表型分化，表達(dá)軟骨特異性指標(biāo)，并合成軟骨基質(zhì)，證明瘢痕成纖維細(xì)胞具有軟骨分化潛能，有望作為燒傷后耳缺損修復(fù)的軟骨種子細(xì)胞。但是，誘導(dǎo)分化后軟骨表型的維持時間、誘導(dǎo)體系的優(yōu)化、誘導(dǎo)分化機(jī)制，及組織工程化耳軟骨構(gòu)建等問題還需進(jìn)一步研究。

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