Langendorff離體心臟灌注模型的制備及應(yīng)用

戴小燕(綜述)，方秋娟(審校)

(1.福建醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生理學與病理生理學系，福州 350004;2.福建莆田學院醫(yī)學院實驗中心，福建莆田 351100)

Langendorff離體心臟灌注模型的制備及應(yīng)用

戴小燕1，2△(綜述)，方秋娟1※(審校)

(1.福建醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生理學與病理生理學系，福州 350004;2.福建莆田學院醫(yī)學院實驗中心，福建莆田 351100)

離體心臟灌注模型通過主動脈逆行插管灌注灌流液，經(jīng)冠狀動脈血管營養(yǎng)心肌，維持離體心臟持續(xù)搏動，可用于器官水平心臟功能研究;或灌注含膠原酶的溶液分離單個心肌細胞用于心肌細胞或分子功能研究。根據(jù)研究目標條件選用適宜動物，成功制備離體心臟Langendorff灌注模型，需要選用合宜的灌注液、控制灌注壓力流量及溫度，嫻熟的麻醉取心、主動脈插管及灌注操作，保證離體心臟良好灌注，才能制得功能良好的離體搏動心臟或心肌細胞，用于心臟生理、藥理、臨床應(yīng)用基礎(chǔ)研究。其與在體心臟相比有一定局限性，但該模型制備簡便經(jīng)濟，重復性好，適用于心臟功能學研究。

Langendorff;離體心臟;灌流;心肌細胞;心臟功能

利用心肌細胞特性，離體心臟通過灌注，一定時間內(nèi)能保持興奮和收縮功能。由于蛙心無冠狀動脈循環(huán)且只有一個心室，最初的離體心臟研究大多在蛙心上完成。哺乳動物心臟具有冠狀動脈循環(huán)，無冠狀動脈灌流，心臟很快停止跳動。1895年，Langendorff［1］發(fā)明了哺乳動物離體心臟灌流裝置，使哺乳動物離體心臟的研究更加方便，因此該裝置迅速成為心血管基礎(chǔ)研究的重要工具?，F(xiàn)在，隨著該技術(shù)的廣泛應(yīng)用，包括心肌缺血/再灌注損傷、心肌細胞治療和移植心臟保存在內(nèi)的眾多研究取得重大突破。現(xiàn)就該模型制備的基本方法、影響因素、臨床應(yīng)用及其優(yōu)缺點予以綜述。

1 Langendorff離體心臟灌流原理

Langendorff模型采用主動脈插管逆行灌注，提供心臟營養(yǎng)物質(zhì)，使心臟保持跳動。逆向灌注使主動脈瓣關(guān)閉，灌流液通過左右冠狀動脈開口進入冠狀動脈系統(tǒng)營養(yǎng)心肌后，除了少量直接進入心腔外，絕大多數(shù)通過心小、中、大靜脈匯集到冠狀竇，最后經(jīng)右心室和肺動脈排出。

2 Langendorff模型制備方法

2.1 動物準備 實驗動物腹腔注射肝素(1000 U/kg)抗凝，防止冠狀動脈及心室腔血栓形成。

手術(shù)前對動物全麻。麻醉途徑有吸入和注射兩種方式。吸入麻醉效能強、易調(diào)控麻醉深度，但需要昂貴的麻醉及氣體清除設(shè)備，而且在缺血預適應(yīng)和缺血后適應(yīng)中具有心肌保護作用［2］;注射麻醉簡單易行，麻醉誘導平穩(wěn)，但麻醉深度不易掌握。因此，實驗者應(yīng)根據(jù)不同實驗動物、研究內(nèi)容及研究條件選擇合適的麻醉途徑。常見的小動物(如小鼠、大鼠、豚鼠等)體形小，易固定，常采用腹腔注射;兔性情溫順，一般選擇耳緣靜脈注射;對于易傷人的犬、貓和體型較大且不易固定的動物，可先肌內(nèi)注射，待其肌肉松弛、不具反抗力時，再視麻醉程度和實驗需要進行靜脈麻醉［3］。

常用注射性麻醉劑有戊巴比妥鈉、水合氯醛、烏拉坦，吸入性麻醉劑有乙醚。單用10%水合氯醛300 mg/kg麻醉效果好，而且對循環(huán)系統(tǒng)影響?。?］。為避免單一用藥引起的麻醉過深或其它不良反應(yīng)，可使用復合麻醉。

2.2 取心臟 觀察動物呼吸、角膜反射、肌松程度和疼痛反應(yīng)，判斷麻醉生效后，劍突下作切口，沿左右肋緣橫向剪開腹前壁，再依次沿左右腋中線縱向剪開兩胸側(cè)壁，將胸壁翻至頭側(cè)，打開心包膜，暴露心臟。左手拇指和食指輕輕提起心臟，暴露心底血管，迅速將其剪斷，取出的心臟立即放入4℃灌流液中停搏，降低心臟代謝防止缺血損傷。

2.3 主動脈插管 在液面下夾住主動脈斷端，將套管插入主動脈，用縫線結(jié)扎固定，盡快恢復冠狀動脈灌流。操作盡量輕巧，防止冠狀動脈損傷。套管管徑與動脈大小應(yīng)匹配。管徑過大，容易造成動脈內(nèi)膜撕脫堵塞灌流口;管徑過小，灌流量不足，結(jié)扎時也易脫落。主動脈插管深淺應(yīng)適宜，過淺灌流液從主動脈分支漏出;過深，擋住冠狀動脈入口甚至損傷主動脈瓣造成瓣膜關(guān)閉不全導致冠狀動脈灌流不足。一般以右心房上緣約2 mm，不超過主動脈瓣口為宜。插管時，讓液體緩慢滴下，防止形成氣栓堵塞冠狀動脈。

如冠狀動脈灌流成功，殘留在冠狀血管內(nèi)的血液瞬間沖出，數(shù)秒內(nèi)心搏恢復。從開胸腔到恢復冠狀動脈灌流需在5 min內(nèi)完成，延遲灌注將導致缺血損傷?；謴凸嗔骱?，剪除多余組織，在肺動脈根部剪一個小口，使灌流液流出通暢。

2.4 心室內(nèi)壓測定 心臟灌流5 min后，切開左心耳，經(jīng)切口向左心室插入球囊，另一端接多導生理記錄儀。向球囊緩慢注入生理鹽水，使囊內(nèi)壓為4～8 mm Hg。隨心臟節(jié)律性收縮與舒張即可檢測左心室收縮壓、舒張末壓等。

球囊心室測壓是利用球囊和心室壁的相互作用。球囊導管的質(zhì)量直接影響心室內(nèi)壓測定。由于市售的乳膠球囊普遍存在球囊過大、過硬等缺點，因此多采取自制球囊［5］。自制球囊的材料分彈性(乳膠薄膜)和非彈性(塑料薄膜)兩種，非彈性材料制作的球囊，變形能力差，舒張末壓難以調(diào)節(jié)。一般選擴展性良好的乳膠薄膜。彈性球囊在心臟舒張時，囊內(nèi)液體要克服彈性膜產(chǎn)生的張力，表現(xiàn)為心室舒張速度下降，所以研究心臟舒張功能實驗，使用非彈性膜制作球囊較好［6］。

2.5 心室起搏 在研究藥物對離體心臟傳導、復極、冠狀動脈流量的影響時，加藥前后要保持固定心率。通過心室起搏，就能消除自主心率對實驗結(jié)果的影響。在心臟移植供心保存實驗過程中，也通過起搏來保持心率和左心室收縮壓力的穩(wěn)定，從而提高實驗結(jié)果的可信度。

3 影響模型穩(wěn)定的因素

3.1 灌注溫度 高溫灌注會引起心肌細胞凋亡，心肌收縮力及冠狀動脈流量下降。特別是41.5℃以上高溫對離體心臟功能抑制和結(jié)構(gòu)損傷明顯，且隨著溫度的升高，抑制和損傷程度加重［7］。低溫灌注會引起心率減慢，心舒張期延長，心室舒張末期容積增加，心肌收縮力增強［8］。因此，維持灌注溫度恒定至關(guān)重要。實驗中，常用恒溫循環(huán)器將灌流系統(tǒng)的灌流液及器官浴槽等溫度保持在(37±0.5)℃。

3.2 灌流液的成分 離體心臟的存活離不開能量供應(yīng)，以維持正常代謝和跨膜離子濃度。灌流液是維持心臟收縮的能量來源。Langendorff模型中常用晶體灌流液，也有報道用血液及紅細胞灌流液。

3.2.1 晶體溶液灌流 迄今為止，Langendorff灌流哺乳動物心臟最常見的碳酸氫鹽緩沖液為Sutherland等［9］所創(chuàng)建，簡稱為 KH液。其成分為(mmol/L)：NaCl 118.5，KCl 4.7，CaCl22.5，NaHCO325，MgSO41.2，KH2PO41.2，葡萄糖 11，持續(xù)充以 95%O2和5%CO2混合氣體，pH 7.4。

傳統(tǒng)的KH液缺少蛋白質(zhì)，不能結(jié)合多余離子鈣，溶液中游離鈣離子超過生物可利用度。高鈣灌流下的心功能接近鈣離子量效關(guān)系的上限。同時，溶液中葡萄糖含量過高，代謝時中間產(chǎn)物的堆積容易造成組織損害。研究者根據(jù)實驗要求對KH液進行修正，使鈣離子(1.2～1.8 mmol/L)更接近生理鈣濃度;同時降低葡萄糖濃度或用丙酮酸鹽、游離脂肪酸替代部分葡萄糖作為底物提供能量。

3.2.2 血液灌流 1970年，Gamble等［10］報道采用活體大鼠提供氧合血來灌注另一只大鼠離體心臟。供血大鼠常規(guī)肝素抗凝、麻醉，機械通氣支持，左股動脈和右股靜脈插管，其中左股動脈流出的血液，經(jīng)蠕動泵逐漸增加灌注流量，通過主動脈插管逆行灌注另一只大鼠的離體心臟。冠狀動脈流出的血液與預充的琥珀酰明膠注射液混合、過濾后，經(jīng)右股靜脈回到供血大鼠體內(nèi)。

血液灌流的離體心臟功能穩(wěn)定，心功能降低速率每小時不超過5%，組織水腫較輕，冠狀動脈流量接近生理正常值。灌流過程易產(chǎn)生進行性溶血，且離體心臟與供血大鼠的代謝物質(zhì)通過循環(huán)互相影響，供血大鼠生命體征的惡化直接威脅到離體心臟的存活。

3.2.3 紅細胞懸液灌流 1979年有文獻報道，用含25%～40%比容的羊紅細胞懸液灌流兔心［11］。新鮮羊血肝素抗凝，200 μm濾膜過濾，反復1000×g離心、棄上清，重懸至上清液澄清透明。洗好紅細胞液按所需紅細胞比容加入含4%右旋糖酐與3 g白蛋白的KH液中。

與血液灌流相似，紅細胞灌流離體心臟穩(wěn)定性較好。由于去除白細胞和血漿蛋白，排斥免疫反應(yīng)較輕。紅細胞懸液制作繁瑣，在氧合過程中需要專用膜式氧合器，且氧合過程容易發(fā)生溶血。

3.3 灌注壓 離體心臟灌注過程中，應(yīng)維持灌注壓恒定。灌注壓波動過大，易損傷冠狀動脈造成心肌水腫，加重缺血/再灌注損傷［12］;壓力過低，冠狀動脈灌注不足;而壓力過高，會損傷主動脈瓣。因此，灌流瓶的高度一般應(yīng)距心臟60～80 cm，可按心臟大小適當調(diào)整，以冠狀動脈流量為5～8 mL/min為宜［13］。

3.4 灌流系統(tǒng)的清潔 灌流管道尤其管道連接處，細菌極易繁殖，形成菌斑和菌塊堵塞冠狀動脈。因此每次實驗結(jié)束后應(yīng)用70%乙醇灌洗15 min，再用無菌蒸餾水清洗10 min。每2周1次使用去污劑或稀鹽酸灌流管道，再用大量蒸餾水沖洗以保持管道清潔。

4 Langendorff模型的優(yōu)缺點

該模型的優(yōu)點是制備簡單，操作方便，費用低廉;實驗因素容易控制，穩(wěn)定性好，重復性強［14］;無其他器官影響及神經(jīng)體液調(diào)節(jié)，整體干擾因素較少，有利于單個實驗因素研究［15］。此外，適用制備該模型的實驗動物多樣。幾乎所有哺乳動物及部分非哺乳動物(如鳥類)的心臟都適合離體灌流。盡管如此，由于成本、血管變異性、麻醉操作難度、灌流液需要量等因素，豬、猴、羊等大型動物的心臟灌流相對較少。鼠類成本低、繁殖快是心血管研究中常用的實驗動物。其中最常用的是大鼠，但大鼠心肌動作電位時程短，缺血后心律失常室顫率較高，一般不用于心律失常及抗心律失常藥物的研究［16］。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)，小鼠的使用日益廣泛。由于小鼠的體型小、心率快，建立離體心臟模型具有一定難度［17］，研究者可根據(jù)不同實驗需求選擇不同的動物。

不足之處是Langendorff模型灌注方式與生理狀態(tài)不符，左心室空虛，心臟不能做功，因此不適于模擬并研究在體心臟功能，也無法直接觀察心室收縮力和氧化代謝的關(guān)系。同時離體心臟維持時間有限，隨著時間推移，心臟各項功能逐漸衰竭。由于內(nèi)外環(huán)境的巨大差異及缺少正常生理調(diào)節(jié)，實驗結(jié)果與在體模型存在一定差異［18］。

5 Langendorf模型的應(yīng)用

5.1 制備心律失常模型 經(jīng)灌流管注入藥物誘發(fā)心律失?；蛐泄跔顒用}左前降支結(jié)扎造成缺血/再灌注心律失常，可研究心律失常的發(fā)生、發(fā)展，還可通過給藥觀察藥物的抗心律失常效應(yīng)。同時運用心電信號設(shè)備，觀察離體心臟表面心電圖、His束電圖、心房和心室單相動作電位，對心臟不同部位心肌的興奮性、傳導性、自律性以及心肌復極過程進行全面評估［19］。

5.2 藥物等對心臟的藥理學效應(yīng) 建立Langendorff模型后，將藥物經(jīng)心臟套管側(cè)管注入心臟或用灌流液配成一定濃度進行主動脈灌流，對比加藥前后的心功能變化，監(jiān)測藥物的量-效關(guān)系，對藥物進行治療效果評價和效價測定;并對冠狀動脈流出液和心臟組織進行生化或分子生物學分析來研究藥物信號通路。

5.3 制備缺血/再灌注模型 Langendorff離體心臟灌流適于離體心臟缺血/再灌注模型、缺血預處理與缺血后處理模型的構(gòu)建，并進行缺血和缺氧效應(yīng)相關(guān)研究。

不同程度或不同等級的全心缺血可以通過完全阻斷(通過夾閉流入管道)或部分限制灌注液流速獲得［20］。心臟局部缺血可以通過結(jié)扎冠狀動脈實現(xiàn)。不同缺血時間造成缺血損傷程度不同。短時間缺血引起心肌頓抑，長時間缺血造成心肌梗死。一般30 min內(nèi)的全心缺血為可逆性損傷，進行缺血前預處理能有效減少梗死面積。在缺血或再灌注初期收集冠狀動脈流出液檢測心肌代謝的標志物或在再灌注末期對心臟組織進行心肌生化和代謝分析。

5.4 分離心肌細胞 心肌細胞是心臟的基本功能單位。在細胞水平直接觀察生理或病理狀態(tài)下心肌活動的改變，能提供最直接的心臟功能信息。利用Langendorff灌流裝置在灌流液中加入生物酶，將含有膠原組織、透明質(zhì)酸和纖維組織等細胞間質(zhì)消化，使心肌細胞相互分開，能獲得單個心肌細胞。

5.5 移植心臟保存 良好的心臟保存是心臟移植成功的保證。長于4 h的保存時間會導致心臟不可逆的功能障礙。臨床實踐中，供體心臟往往來源于另外一個地區(qū)，那么增加數(shù)小時的保存時間將有重大意義。Fitton等［21］改進了灌流裝置以保證移植前24 h心臟不間斷的低溫灌注，為供移植心臟提供了一個有效的保存方法。

6 結(jié)語

從19世紀末發(fā)明至今，Langendorff離體心臟灌注模型存在自身局限性，但是憑借其較高的可重復性、良好的穩(wěn)定性和相對較低的技術(shù)要求等優(yōu)點，該模型在探索心肌收縮功能、心肌電生理、冠狀動脈血管功能等研究中發(fā)揮著不可替代的作用，為在體動物實驗及人類心肌保護研究奠定了堅實的基礎(chǔ)，成為心血管研究領(lǐng)域中最為廣泛使用的實驗?zāi)Ｐ椭弧?/p>

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Preparation and Application of Langendorff Isolated Heart Perfusion Model
1

DAI Xiao-yan1，2，F(xiàn)ANG Qiu-juan.(1.Department of Physiology and Pathophysiology，School of Basic Medical Sciences，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou350004，China;2.Experiment Center，Medical College of Putian University，Putian351100，China)

The isolated heart perfusion model is set up by perfusion through the catheter intubated backward into aorta to coronary artery to supply myocardium nutrition to keep the isolated heart beating.It can be used in heart function study at organ level;or it can also be perfused with solution containing collagenase for preparation isolated myocytes used in the study of the myocyte function at cell or molecule level.The kind of animal selected for Langendorff perfusion is decided by research purpose and condition.To prepare an ideal Langendorff perfusion heart needs appropriate solution and perfusion pressure and temperature，skilled anaesthesia heart taking and intubating aorta and perfusing operation，ensuring good heart perfusion，which are essential to get functional isolated beating heart or myocytes for the study of heart physiology，pharmacology or clinical basic application.Although it has some limits compared with the heart in vivo，the preparation of isolated Langendorff perfusion heart is easy and economical with good repeatability，making it appropriate for the heart function research.

Langendorff;Isolated heart;Perfusion;Myocyte;Heart function

R33

A

1006-2084(2012)13-2036-04

福建省教育廳科技重點項目(JA07081)

2011-11-30

2012-02-23 編輯：伊姍