量子點(diǎn)熒光技術(shù)在活體動(dòng)物移植瘤方面的應(yīng)用研究

李艷芬(綜述)，陳 坤 ，張鐵柱(審校)

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，廣東湛江524023)

惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類生命健康的最主要疾病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究中心報(bào)告:2008年全球760萬(wàn)人死于惡性腫瘤，新發(fā)惡性腫瘤病例約1240萬(wàn)，現(xiàn)患腫瘤患者數(shù)量達(dá)2800 萬(wàn)［1］。盡管人類對(duì)于惡性腫瘤的檢測(cè)、診斷及治療進(jìn)行了長(zhǎng)期、艱苦的不懈努力，但始終未能取得突破性進(jìn)展。近年來(lái)，量子點(diǎn)以其獨(dú)有的特性應(yīng)用于腫瘤方面的研究已成為人們廣泛關(guān)注的研究熱點(diǎn)之一。尤其是作為一種新型熒光探針應(yīng)用于腫瘤方面，如量子點(diǎn)在活體動(dòng)物移植瘤體內(nèi)外成像、靶向標(biāo)記特異組織和細(xì)胞、腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)及腫瘤的治療等方面均取得了新的進(jìn)展，前景十分廣闊?，F(xiàn)就近年來(lái)量子點(diǎn)在活體動(dòng)物移植瘤模型中的應(yīng)用予以綜述。

1 量子點(diǎn)的特性及其功能化修飾

量子點(diǎn)，也稱半導(dǎo)體納米晶，它是由Ⅱ～Ⅵ族元素或Ⅲ～Ⅴ族元素組成的尺寸＜100 nm的半導(dǎo)體納米微晶體，由金屬核(如硒化鎘)和外殼(如硫化鋅)組成，這些半導(dǎo)體納米微晶體由于受到量子尺寸效應(yīng)和介電限域效應(yīng)的影響，表現(xiàn)出獨(dú)特的光電屬性:量子點(diǎn)與傳統(tǒng)的有機(jī)熒光分子材料相比，具有激發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬且連續(xù)分布，而其發(fā)射波長(zhǎng)的范圍窄且呈對(duì)稱分布，可檢測(cè)到的光譜范圍內(nèi)同時(shí)使用多個(gè)探針，發(fā)射光譜不出現(xiàn)交疊。由于量子點(diǎn)具有尺寸可調(diào)的特性，通過(guò)改變其尺寸或內(nèi)核的組分可以在很大范圍內(nèi)調(diào)節(jié)量子點(diǎn)的發(fā)射光譜，這樣僅用一種波長(zhǎng)的激發(fā)光源便可激發(fā)多種熒光，進(jìn)行多元熒光檢測(cè)。量子點(diǎn)的光穩(wěn)定性好，熒光壽命長(zhǎng)且耐光漂白，可以經(jīng)受反復(fù)多次的激發(fā)，這為研究生物體活體成像及細(xì)胞中生物分子之間長(zhǎng)時(shí)間相互作用提供了有力工具［2-6］。應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的量子點(diǎn)，必須是水溶性的，這樣更容易與處在水溶性環(huán)境中的生物分子(如蛋白質(zhì)、DNA、肽類等)相結(jié)合。但是，無(wú)論通過(guò)金屬合成還是水相合成的量子點(diǎn)都帶有疏水的表面活性分子，而不易與生物分子相結(jié)合，必須對(duì)其表面進(jìn)行修飾，使其具有良好的生物相容性?？梢酝ㄟ^(guò)靜電引力、氫鍵作用或特異的配體受體相互作用將生物分子結(jié)合在量子點(diǎn)的表面［7-8］。

2 量子點(diǎn)在活體動(dòng)物移植瘤中的應(yīng)用

多年來(lái)，在探索腫瘤的發(fā)生機(jī)制、轉(zhuǎn)移機(jī)制、診斷及治療的過(guò)程中，由于受到倫理學(xué)等方面的限制，很難在人體上完整獲得對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等過(guò)程的檢查、取材等方面的資料。而活體動(dòng)物在基因與遺傳方面與人類較為接近，量子點(diǎn)極強(qiáng)的熒光穩(wěn)定性使其在活體動(dòng)物方面的研究成為可能。動(dòng)物活體中量子點(diǎn)作為光學(xué)對(duì)比劑結(jié)合熒光成像系統(tǒng)可進(jìn)行腫瘤的定位，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，對(duì)腫瘤動(dòng)力學(xué)的研究及指導(dǎo)癌癥手術(shù)提供了幫助［9］。

2.1 量子點(diǎn)在移植瘤動(dòng)物中成像 量子點(diǎn)優(yōu)越的光學(xué)屬性使其被廣泛應(yīng)用于生物體內(nèi)腫瘤的定位成像研究。在目前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將近紅外量子點(diǎn)制成特異性的生物探針，用于活體腫瘤成像、淋巴結(jié)成像及血管成像等是研究的熱點(diǎn)之一。量子點(diǎn)成像作為一種新型腫瘤成像技術(shù)，將有廣泛的應(yīng)用前景［10］。

2.1.1 活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤成像 2004年 Gao等［11］首次對(duì)小動(dòng)物體內(nèi)腫瘤進(jìn)行了活體成像，他們用一種新型的多功能量子點(diǎn)探針——聚乙二醇包被的量子點(diǎn)標(biāo)記前列腺特異性膜抗原的抗體，經(jīng)小鼠尾靜脈注射，能夠?qū)?dòng)物活體內(nèi)的腫瘤進(jìn)行靶向，成功實(shí)現(xiàn)了前列腺癌模型的非損傷性成像。Diagaradjane等［12］將分別中度表達(dá)和高表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的人結(jié)腸癌細(xì)胞株H CT116和DiFi接種到雄性裸鼠后腿皮下，待腫瘤生長(zhǎng)至0.8～1 cm時(shí)，尾靜脈注射10 pmol耦聯(lián)了表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)的氨基化CdSeTe/ZnS量子點(diǎn);作為對(duì)照，另一組裸鼠注射未耦聯(lián)EGF的量子點(diǎn)，分別于注射后0、3 min和1、4、24 h用活體成像影像系統(tǒng)對(duì)吸入麻醉狀態(tài)下的裸鼠進(jìn)行活體成像，注射后4 h時(shí)，兩組在腫瘤區(qū)域的熒光強(qiáng)度具有顯著差異。Yang等［13］用發(fā)射波長(zhǎng)為800 nm的量子點(diǎn)連接EGFR標(biāo)記口腔鱗癌BcaCD885制作量子點(diǎn)800-EGFR探針，并通過(guò)靜脈注射到高表達(dá)EGFR的動(dòng)物移植瘤動(dòng)物模型中，結(jié)果顯示:量子點(diǎn)800-EGFR探針檢測(cè)到BcaCD885細(xì)胞強(qiáng)熒光信號(hào)，量子點(diǎn)探針注射后腫瘤成像的最大信噪比從15 min至6 h，在裸鼠頭頸移植瘤部位實(shí)現(xiàn)了原位在體的活體成像。這些研究結(jié)果表明，量子點(diǎn)標(biāo)記的熒光探針在活體中能特異性地靶定腫瘤部位，為腫瘤研究提供了一種可視化實(shí)時(shí)在體觀測(cè)的研究方法。

2.1.2 活體動(dòng)物前哨淋巴結(jié)成像 前哨淋巴結(jié)能準(zhǔn)確反映整個(gè)淋巴結(jié)群的狀態(tài)，是腫瘤轉(zhuǎn)移到達(dá)的第1站淋巴結(jié)。檢測(cè)前哨淋巴結(jié)對(duì)于腫瘤的TMN分期及預(yù)后意義重大，對(duì)于精確手術(shù)范圍和明確治療方案具有指導(dǎo)意義。大顆粒量子點(diǎn)能發(fā)射高穿透性的近紅外線，可用于前哨淋巴結(jié)檢測(cè)。Kim等［14］將發(fā)射近紅外線的Ⅱ型量子點(diǎn)注射入小鼠前爪及豬腹股溝皮下，在鹵燈激發(fā)下實(shí)現(xiàn)了腋窩及腹股溝皮下1 cm深度的前哨淋巴結(jié)精確定位成像。通過(guò)量子點(diǎn)標(biāo)志，醫(yī)師可看清1 cm深組織下的前哨淋巴結(jié)，從而可準(zhǔn)確地指導(dǎo)手術(shù)進(jìn)行，確保前哨淋巴結(jié)的完全切除。Knapp等［15］研究報(bào)道了利用近紅外量子點(diǎn)在犬和豬中對(duì)浸潤(rùn)性膀胱腫瘤的前哨淋巴結(jié)術(shù)中實(shí)時(shí)顯像。黃雪蕾等［16］用近紅外熒光材料量子點(diǎn)800標(biāo)記尼妥珠單抗，制備成熒光抗體探針，經(jīng)尾靜脈注射到Tcca8113舌鱗癌裸鼠皮下移植瘤動(dòng)物模型中，結(jié)果表明量子點(diǎn)800對(duì)動(dòng)物模型的舌前哨林巴結(jié)示蹤效果良好，能在活體內(nèi)清楚地顯示舌部注射后引流的頸部前哨淋巴結(jié)位置，熒光強(qiáng)度高、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，且長(zhǎng)時(shí)間停留于前哨淋巴結(jié)內(nèi)。這些實(shí)驗(yàn)均表明量子點(diǎn)在活體動(dòng)物的前哨淋巴結(jié)成像可以非常準(zhǔn)確地對(duì)腫瘤組織、前哨淋巴結(jié)進(jìn)行定位標(biāo)記，這為臨床在手術(shù)中指導(dǎo)醫(yī)師實(shí)施精確而徹底的腫瘤根治手術(shù)提供了可能的新方法。

2.1.3 活體動(dòng)物內(nèi)血管成像 腫瘤組織周圍血管豐富，細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖迅速，由于通常所用有機(jī)熒光材料激發(fā)光譜窄而發(fā)射光譜寬且易發(fā)生熒光漂白，不能在體實(shí)時(shí)對(duì)多種組織成像，而量子點(diǎn)熒光探針以其無(wú)以比擬的優(yōu)越性可用于檢測(cè)腫瘤的血管變化。Morgan等［17］用牛血清白蛋白包裹的CdMnTe/Hg量子點(diǎn)作為血管造影劑，通過(guò)皮下注射或靜脈注射到裸鼠和C3H小鼠動(dòng)物模型中，結(jié)果顯示，量子點(diǎn)能夠?qū)3H小鼠的鱗狀細(xì)胞癌血管進(jìn)行定位，可以通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)腫瘤血管，并通過(guò)對(duì)小鼠心臟的成像確定該量子點(diǎn)的組織穿透深度。這為通過(guò)藥物進(jìn)行靶向治療提供了一條新的探索途徑。Stroh等［18］將量子點(diǎn)、多光子成像技術(shù)和表達(dá)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因老鼠相結(jié)合，對(duì)腫瘤血管周圍的細(xì)胞和組織進(jìn)行研究。結(jié)果證實(shí)不同尺寸的這些納米熒光晶體可以進(jìn)入到腫瘤組織實(shí)時(shí)成像，并可從血管周圍的細(xì)胞和組織中區(qū)分出腫瘤血管，還成功地利用量子點(diǎn)標(biāo)記骨髓干細(xì)胞監(jiān)測(cè)由骨髓補(bǔ)充到腫瘤脈管系統(tǒng)的過(guò)程，這為多功能的量子點(diǎn)用于腫瘤病理生理學(xué)研究及抗腫瘤治療提供了一種新方法。

2.2 腫瘤標(biāo)志物檢測(cè) 腫瘤標(biāo)志物是存在于腫瘤細(xì)胞內(nèi)或腫瘤細(xì)胞表面或脫落的物質(zhì)，或是宿主對(duì)腫瘤反應(yīng)而產(chǎn)生的物質(zhì)。腫瘤標(biāo)志物在惡性腫瘤診治中具有重要作用，但因其特異性和敏感性欠佳，限制了其廣泛應(yīng)用。量子點(diǎn)能夠接受激發(fā)光產(chǎn)生熒光標(biāo)志物，比傳統(tǒng)熒光探針有明顯的優(yōu)越性。2003年，Wu等［19］首次將量子點(diǎn)連接IgG和鏈霉親和素用于特異性生物標(biāo)志物Her2的標(biāo)記，并用一種光源對(duì)2種靶物質(zhì)同時(shí)進(jìn)行了成像，結(jié)果顯示，量子點(diǎn)熒光探針能夠有效的靶向標(biāo)記腫瘤細(xì)胞中的Her2，并可同時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行多元性檢測(cè)。Yu等［20］用硒化鎘/硫化鋅量子點(diǎn)耦聯(lián)鼠抗人甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)抗體來(lái)識(shí)別肝癌標(biāo)志物AFP，量子點(diǎn)AFP抗體探針通過(guò)尾靜脈注射到小鼠內(nèi)。點(diǎn)對(duì)點(diǎn)激光照射獲取腫瘤部位和正常組織的熒光信號(hào):熒光主要分布在肝癌組織上，周圍組織的熒光強(qiáng)度迅速下降，基本無(wú)非特異性分布。盤杰等［21］利用量子點(diǎn)的光學(xué)優(yōu)點(diǎn)，將其作為熒光探針檢測(cè)裸鼠舌鱗癌移植瘤組織切片中Bcl-2蛋白，結(jié)果顯示蛋白定位準(zhǔn)確，特異性強(qiáng)。認(rèn)為量子點(diǎn)熒光探針可應(yīng)用舌鱗癌裸鼠模型的腫瘤組織切片，特別是冰凍組織切片中檢測(cè)特定蛋白，可實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤組織多種蛋白的同時(shí)檢測(cè)，為進(jìn)一步研究口腔鱗癌動(dòng)物模型中腫瘤組織的特定蛋白及蛋白組織學(xué)提供新的研究手段。

2.3 活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移方面的研究 腫瘤細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)與腫瘤細(xì)胞侵入周圍組織細(xì)胞密切相關(guān)，對(duì)于形成轉(zhuǎn)移性腫瘤非常有害。腫瘤能夠通過(guò)脈管系統(tǒng)進(jìn)行局部或者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，它也是造成晚期腫瘤患者難以治愈的主要原因。動(dòng)態(tài)地研究腫瘤細(xì)胞的侵襲軌跡有助于了解腫瘤細(xì)胞對(duì)正常組織的破壞作用。隨著對(duì)量子點(diǎn)研究的不斷深入，越來(lái)越多地發(fā)現(xiàn)量子點(diǎn)在腫瘤轉(zhuǎn)移的檢測(cè)方面具有巨大的潛力［22］。

Jaiswal等［23］和 Voura 等［24］最早探索將二氫基硫辛酸修飾的量子點(diǎn)標(biāo)記活細(xì)胞，并將載有這種量子點(diǎn)且具肺轉(zhuǎn)移能力的B16F10(黑素瘤)細(xì)胞通過(guò)尾靜脈注入小鼠體內(nèi)后，在處死的小鼠肺組織中觀察到量子點(diǎn)發(fā)出的熒光。其研究結(jié)果表明量子點(diǎn)是一種優(yōu)良的示蹤探針，可用于研究腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)行為，并為腫瘤轉(zhuǎn)移研究提供了理論基礎(chǔ)。Shi等［25］報(bào)道，利用近紅外光發(fā)射量子點(diǎn)連接抗前列腺特異性膜抗體后可使小鼠骨頭中前列腺癌微轉(zhuǎn)移灶在體顯像。2008年Chen等［26］將量子點(diǎn)用于動(dòng)物體內(nèi)肝腫瘤肺轉(zhuǎn)移的檢測(cè)，他們將巰基乙酸修飾的水溶性量子點(diǎn)結(jié)合AFP單克隆抗體制備成水溶性量子點(diǎn)-AFP-Ab復(fù)合物探針，通過(guò)尾靜脈注射到建立的肝癌肺轉(zhuǎn)移模型的裸鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示，該探針可精確靶向肺部轉(zhuǎn)移灶，說(shuō)明其對(duì)肝癌微小轉(zhuǎn)移灶的檢測(cè)同樣具有很高的研究?jī)r(jià)值，這將有助于肝癌的早期診斷和治療。目前，盡管量子點(diǎn)對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的研究不斷深入，但是能真正地將其用于臨床還需要進(jìn)一步的研究。

2.4 腫瘤治療方面的應(yīng)用

2.4.1 靶向治療 目前對(duì)于腫瘤的治療，臨床上一般采用外科切除、放射治療及化學(xué)治療，這些治療方法均可導(dǎo)致機(jī)體不同程度的受到損傷。傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物缺乏選擇性，癌細(xì)胞靶向能力低，不良反應(yīng)大。靶向治療是指借助各種對(duì)腫瘤細(xì)胞有選擇性親和作用的物質(zhì)為載體，使藥物定向作用于腫瘤組織而不損傷正常組織細(xì)胞的治療方法。由于腫瘤部位血管內(nèi)皮的通透性較高，納米粒子載藥具有較小的尺寸，容易透過(guò)和在腫瘤部位聚集而獲得被動(dòng)靶向效應(yīng)。Shenoy等［27］報(bào)道制備的聚乙烯納米粒載藥三苯氧胺較游離藥物水溶性好，在血液中循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)，作用于乳腺癌裸鼠模型，可在腫瘤組織中高濃度蓄積，與應(yīng)用游離藥物的方法相比，顯示出對(duì)乳腺癌的靶向性。

2.4.2 光動(dòng)力學(xué)治療 光動(dòng)力學(xué)療法治療惡性腫瘤是近20余年興起并不斷發(fā)展的新技術(shù)，其原理是利用光敏劑選擇性聚積、儲(chǔ)留于腫瘤組織內(nèi)，并能在特定波長(zhǎng)的光照下，通過(guò)光化學(xué)或光生物學(xué)反應(yīng)對(duì)瘤組織產(chǎn)生殺傷效應(yīng)，從而達(dá)到局部治癌目的。量子點(diǎn)以其優(yōu)越的光學(xué)特性可以用作光敏劑來(lái)介導(dǎo)光動(dòng)力學(xué)療法，能對(duì)目標(biāo)癌細(xì)胞準(zhǔn)確定位進(jìn)行靶向治療腫瘤而殺傷周圍正常細(xì)胞，被證明利用紫外線調(diào)節(jié)的毒性作為殺死癌細(xì)胞的一種途徑［28-29］。Bakalova等［30］將水溶性的硒化鎘量子點(diǎn)連接于對(duì)白血病細(xì)胞有特異性的抗CD抗體上，將標(biāo)記的白血病細(xì)胞與正常的淋巴細(xì)胞混合，在經(jīng)典光敏劑存在或缺失的情況下同時(shí)受到紫外線照射，結(jié)果顯示，量子點(diǎn)連接的抗CD使白血病細(xì)胞對(duì)紫外光照射敏感，同時(shí)證明在經(jīng)典光敏劑存在的情況下可以增加其效果。這些治療方法是利用量子點(diǎn)對(duì)于治療腫瘤的新探索。

3 小結(jié)及展望

量子點(diǎn)作為一種新型的納米熒光探針，以其獨(dú)特的光學(xué)性能在活體動(dòng)物移植瘤中的研究中得到了廣泛的應(yīng)用，它能夠?qū)ι矬w內(nèi)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移提供動(dòng)態(tài)的監(jiān)測(cè)，對(duì)于疾病的診斷、治療和預(yù)后提供了新的手段，更為將來(lái)能夠應(yīng)用于臨床打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，應(yīng)用前景十分廣闊。但是，量子點(diǎn)應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域還存在很多問(wèn)題，如量子點(diǎn)的毒性問(wèn)題，量子點(diǎn)的表面修飾會(huì)造成量子點(diǎn)空間位阻增大，以及理化性質(zhì)改變的問(wèn)題，量子點(diǎn)在體內(nèi)的排泄等仍是限制其體內(nèi)應(yīng)用的重要因素。盡管如此，隨著對(duì)量子點(diǎn)研究的不斷深入，量子點(diǎn)在活體動(dòng)物成像、腫瘤標(biāo)志物示蹤及腫瘤轉(zhuǎn)移等方面已取得了一定的進(jìn)展。在目前的動(dòng)物移植瘤試驗(yàn)中，不斷優(yōu)化和完善量子點(diǎn)的性能，降低其毒性，并能通過(guò)排泄器官在體內(nèi)清除，使之成為具有高敏感性及高穩(wěn)定性的探針，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地監(jiān)測(cè)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移，為量子點(diǎn)探針應(yīng)用于臨床的診斷及治療建立一個(gè)新的平臺(tái)，是今后的研究方向。

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