微小核糖核酸在參與缺血/再灌注過程中的研究進展

黃鄧君(綜述)，魏煜程，沈 毅(審校)

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科，山東青島 266000)

微小核糖核酸(micro-ribonucleic acid，miRNA)是一種5'端帶磷酸基團、3'端帶羥基，長度為18～25個核苷酸存在于真核生物中的非編碼調(diào)控RNA，現(xiàn)已證實miRNA通過與靶mRNA結(jié)合以及調(diào)節(jié)靶mRNA的蛋白質(zhì)翻譯過程來調(diào)控基因的表達。既往已有關(guān)于miRNA與腫瘤之間的相關(guān)性研究，因缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury，I/R)是器官移植術(shù)后的重要難題，故如今研究的重點已轉(zhuǎn)向miRNA參與I/R過程中細胞凋亡、增殖與分化以及炎性反應(yīng)的研究上?，F(xiàn)簡要介紹miRNA在參與I/R過程中的研究進展，以期在分子水平上為早期診斷及干預(yù)I/R提供理論依據(jù)。

1 miRNA概述

1.1 miRNA的發(fā)現(xiàn) 1993年Lee等［1］首次在秀麗隱桿線蟲發(fā)現(xiàn) miR-lin-4，隨后科學(xué)家 Reinhart等［2］在線蟲中發(fā)現(xiàn)另外一種miR-let-7。目前在人類、動植物等物種中已有8000余種miRNA被發(fā)現(xiàn)，這些miRNA的序列在進化關(guān)系較近的物種間具有保守性，人類基因組中已確認的有800多種，參與生命過程中的一系列重要進程，包括早期胚胎發(fā)育、細胞增殖、細胞分化以及細胞凋亡［3-4］。

1.2 miRNA的形成及其作用機制 核酸酶Drosha在胞核內(nèi)加工miRNA的初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(初miRNA)成為miRNA的前體［5］，miRNA的前體由60～90個核苷酸構(gòu)成，呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)，細胞核內(nèi)的miRNA前體由Ran-GTP酶以及其受體輸出蛋白-5轉(zhuǎn)運出細胞核進入細胞質(zhì)中，并由胞質(zhì)中的RNaseⅢ-Dicer酶剪切出成熟的雙鏈miRNA。通常情況下，雙鏈RNA中的一條單鏈會與核糖核蛋白形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，另一條鏈發(fā)生降解;當(dāng)然也有一些miRNA雙鏈會分別與不同的核糖核蛋白結(jié)合。RISC通過miRNA的指導(dǎo)與靶mRNA結(jié)合從而剪切靶mRNA或者抑制靶mRNA的翻譯(兩種方式)來執(zhí)行miRNA的基因沉默功能［6］。RISC與靶mRNA的結(jié)合若是部分互補的，則可抑制靶mRNA的翻譯;若其結(jié)合是完全互補的，則可降解靶mRNA。在植物中通常采用第一種方式，第二種方式通常在動物中發(fā)生。例如果蠅的let-7直接介導(dǎo)RISC剪切靶mRNA;而當(dāng)與靶mRNA不完全互補結(jié)合時，調(diào)節(jié)基因的表達;線蟲中的1et-7與靶mRNA不完全配對結(jié)合后，抑制靶 mRNA 的翻譯［7］。Wu等［8］提出另外一種去腺苷酸化機制參與miRNA的基因調(diào)控。其依據(jù)是已知lin-28與miR-125b呈不完全互補方式結(jié)合，當(dāng)把miR-125b轉(zhuǎn)入人類胚胎腎細胞293T后發(fā)現(xiàn)連接了lin-28的p-球蛋白mRNA明顯縮短，這種縮短與腺苷酸的清除有關(guān)。一個miRNA可調(diào)節(jié)數(shù)個甚至數(shù)百個不同的靶mRNA，而幾種不同的miRNA也可以聯(lián)合調(diào)控單一的靶mRNA，miRNA和靶mRNA組成了復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)［9］。

1.3 miRNA的命名 miRNA的命名遵循以下制訂的幾個原則［10-11］:①miRNA簡寫成為miR，根據(jù)被克隆出來的先后順序加上阿拉伯?dāng)?shù)字，比如miR-125;②將物種縮寫置于miR的前面，比如has-miR-125;③高度同源的miRNA在數(shù)字后面加上英文小寫字母以示區(qū)分，比如miR-125a和miR-125b;④根據(jù)由不同染色體上的DNA轉(zhuǎn)錄而成的具有相同成熟體序列的miRNA，在后面再加上阿拉伯?dāng)?shù)字，比如miR-125a-1和miR-125a-2;⑤由同一前體的兩個臂分別產(chǎn)生的miRNA，根據(jù)克隆實驗表達水平較低的miR后面加*，例如miR-125a和miR-125a*，或者命名miR-125-5p(表示從5'端的臂上加工而來);⑥在規(guī)則確定之前發(fā)現(xiàn)的miRNA保留原來的名字，如let-7等。

2 I/R與肺移植

肺移植是臨床上治療終末期肺病的唯一有效手段，目前臨床上已經(jīng)成功實現(xiàn)單肺、雙肺以及心肺聯(lián)合移植。但是，肺移植術(shù)后出現(xiàn)I/R是無法避免的一個難題，也是導(dǎo)致手術(shù)失敗的主要原因之一。I/R對臟器造成的損傷機制極其復(fù)雜，包括缺血期損傷和再灌注期損傷;缺血期急性缺氧造成三磷酸腺苷的減少，進而導(dǎo)致細胞內(nèi)離子紊亂和水解酶激活，造成組織損傷;再灌注過程中組織產(chǎn)生大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，進而加重組織損傷。ROS是I/R中主要的損傷因子，它在再灌注期損傷中扮演著激活組織中炎性細胞，釋放白細胞介素、腫瘤干擾因子等一系列炎性因子，促進組織細胞凋亡，加重組織損傷的角色。肺移植術(shù)后早期有15%～20%的移植肺功能發(fā)生障礙，而初期發(fā)生移植肺功能障礙的主要原因是I/R，發(fā)生I/R后肺實質(zhì)細胞出現(xiàn)凋亡，肺組織出現(xiàn)壞死，臨床表現(xiàn)為進行性低氧血癥、肺順應(yīng)性減小等一系列肺功能障礙。I/R發(fā)生的病理生理貫穿于供肺的切取、保存及再灌注的整個過程。為此，人們進行了不懈努力，主要集中于對移植肺有保護作用的物理因素(缺血預(yù)處理，氧濃度，膽堿能抗炎通路)及藥物上。從分子水平上研究肺組織I/R發(fā)生機制研究甚少。I/R的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多步驟的復(fù)雜過程。尋找發(fā)生肺組織I/R的分子機制，可為早期診斷及治療肺組織發(fā)生I/R提供理論基礎(chǔ)，甚至可為更深入地了解肺部疾病的發(fā)生機制提供研究靶點。

3 miRNA在基因表達中的調(diào)控作用

關(guān)于miRNA調(diào)節(jié)細胞增殖的研究有:Bantam是果蠅中一個能抑制細胞凋亡、促進細胞增殖的miRNA，它可抑制誘導(dǎo)果蠅細胞凋亡的Hid蛋白的表達，從而促進細胞增殖［12］;Chan 等［13］研究表明，miRNA-21在人類惡性膠質(zhì)瘤中普遍表達，并且通過抑制miRNA-21的表達，惡性膠質(zhì)瘤細胞數(shù)目減少，而且胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶7活性增加了3倍，凋亡明顯升高。關(guān)于miRNA調(diào)節(jié)細胞凋亡的研究有:Cimmino等［14］發(fā)現(xiàn) miRNA-15a和 miRNA-16-1通過調(diào)控Bcl-2蛋白的表達參與細胞的凋亡過程;Alex等［15］研究指出，ROS在缺氧環(huán)境下刺激缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)和血管內(nèi)皮生長因子表達上調(diào)及缺氧誘導(dǎo)的多種miRNA上調(diào)。HIF-1屬于在細胞內(nèi)氧濃度改變而引起的一系列反應(yīng)中起關(guān)鍵調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一。在缺氧情況下HIF-1降解受阻，合成增多，結(jié)果是HIF-1水平上升，轉(zhuǎn)錄活性增強。同時指出在缺氧情況下，miR-210、miR-30b、miR-93、miR-181b 的表達水平發(fā)生改變，并證實它們是在缺氧情況下調(diào)節(jié)HIF-1表達的 miRNA。Ivan等［16］指出 miR-210等3種 miRNA在缺氧情況下會發(fā)生至少2倍的變化。

4 miRNA與炎性反應(yīng)

I/R 的基本特征之一是炎性反應(yīng)，已有多篇文獻報道m(xù)iRNA與免疫、炎性反應(yīng)之間的關(guān)系［17-20］。在實驗動物的肺組織中進行的研究有:Moschos等［21］用脂多糖建立小鼠肺部炎癥模型，注入脂多糖3 h后用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)從肺中檢測到46種 miRNA的表達改變，其中以 miR-21、miR-25、miR-27b、miR-100、miR-140、miR-142-3p、miR-181c、miR-187、miR-194、miR-214、miR-223、miR-224 等 12種miRNA表達上調(diào)尤為明顯，并與肺部浸潤的炎性細胞、細胞因子增多密切相關(guān)，提示miRNA在肺部炎性反應(yīng)種扮演重要的角色。Rodriguez等［22］研究顯示，缺乏miR-155的小鼠肺的重構(gòu)性增強，支氣管肺泡中白細胞數(shù)量增加，并且檢測出炎性刺激時B細胞、T細胞反應(yīng)減弱和樹突狀細胞功能下降。這證實了miR-155在調(diào)節(jié)與T細胞功能相關(guān)的基因表達和炎性反應(yīng)方面有重要作用。Johnnidis等［23］以去除了編碼miR-223基因的小鼠為研究對象，觀察到了過度成熟的粒細胞表型，對外界刺激的敏感性上調(diào)，同時實驗顯示這些小鼠會產(chǎn)生自發(fā)性的肺部炎性反應(yīng)，在非致死濃度的脂多糖的刺激下即可產(chǎn)生嚴(yán)重的炎性反應(yīng)組織損傷，提示miR-223在肺組織粒細胞的炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)中起著重要作用。在人肺泡上皮細胞中的研究有:Perry等［24］研究表明使用白細胞介素1β(interleukin-1beta，IL-1β)刺激人肺泡上皮細胞系A(chǔ)549后很快在肺泡上皮細胞中檢測到miR-146a和miR-146b這兩種miRNA的表達水平上調(diào)，但是在支氣管上皮細胞中只檢測到miR-146a上調(diào);提前用地塞米松處理的組別中仍能檢測到miR-146a和miR-146b的表達水平上調(diào)，但是其上調(diào)水平有所下降。進一步的研究表明抑制miR-146a導(dǎo)致白細胞介素8(interleukin-8，IL-8)、調(diào)節(jié)正常T細胞表達和分泌的細胞因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted，RANTES)的釋放增加，抑制miR-146b可輕微降低IL-8的產(chǎn)生，對RANTES的影響不甚明顯。而 miR-146a、miR-146b對 IL-8和RANTES的mRNA轉(zhuǎn)錄水平無影響，提示miR-146a、miR-146b在肺炎性反應(yīng)中表達上調(diào)可能是通過抑制IL-8和RANTES蛋白的翻譯過程來調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的。

5 miRNA在I/R過程中表達變化的研究進展

5.1 miRNA在腦I/R過程中的表達 Jeyaseelan等［25］在2008年通過構(gòu)建局灶性腦缺血模型，發(fā)現(xiàn)再灌注24 h 和 48 h 后，let-7、miR-7、miR-27a、miR-98、miR-137、miR-204、miR-218、miR-301、miR-338、miR-335、miR-376、miR-424 等下調(diào);miR-210、miR-215、miR-451、miR-497、miR-134等上調(diào)，同時研究證實在急性腦缺血早期主要病理變化尚未出現(xiàn)時，miRNA的表達已經(jīng)發(fā)生了明顯變化，表明miRNA在神經(jīng)系統(tǒng)缺血期的病理過程中發(fā)揮著重要作用。

5.2 miRNA在肝 I/R過程中的表達 有文獻報道［26］通過制作肝I/R模型，發(fā)現(xiàn)缺血2 h后miR-223表達水平與丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶含量呈正相關(guān)。Xu等［27］隨后在缺血預(yù)處理后的肝I/R模型中檢測到78種miRNA發(fā)生了至少2倍差別的變化，其中40種下調(diào)、38種上調(diào)，與未預(yù)處理的肝 I/R 組比較，miR-23a、miR-326、miR-346、miR-370顯著表達下調(diào)，提示miRNA在肝I/R過程中同樣發(fā)揮著重要作用。

5.3 miRNA在心肌I/R過程中的表達 Tang等［28］在大鼠心肌I/R模型中發(fā)現(xiàn)miR-1與Bcl-2蛋白表達呈負相關(guān)，同時在體外實驗中證實miR-1在缺氧環(huán)境中明顯上調(diào)，并明確了miR-1的靶基因是Bcl-2。miR-1抑制Bcl-2的蛋白表達，從而在心肌細胞的凋亡中發(fā)揮作用。同年，Ren等［29］通過體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)miR-320在心肌缺血情況下表達顯著下調(diào)，并發(fā)現(xiàn)miR-320過表達時心肌細胞凋亡明顯上升。潘振偉等［30］利用手術(shù)套管法建立原位大鼠心肌缺血預(yù)適應(yīng)模型發(fā)現(xiàn)，建模4 h后I/R區(qū)心肌rno-miR-206、btalet-7g、rno-let-7c、rno-let-7f、rno-miR-1 等 5 個 miRNA表達上調(diào)，rno-miR-7d* 、rno-miR-193、rno-miR-290、rno-miR-292-5p等4個miRNA表達下調(diào)，但是miRNA在心肌I/R過程中的作用值得進一步研究。

5.4 miRNA在腎I/R過程中的表達 吳鈺等［31］采用雙側(cè)夾閉小鼠腎蒂的方法制造急性I/R腎損傷模型，發(fā)現(xiàn)在腎I/R 4 h及24 h后miRNA-92a的表達水平顯著上調(diào)，同時提示miRNA-92a在缺血性疾病中可以誘導(dǎo)靶向血管相關(guān)因子，并且可能參與血管新生的信號途徑，促進血管生成，提示miRNA在腎I/R過程中承擔(dān)重要的角色。

6 結(jié)語

miRNA在多種器官組織I/R過程中發(fā)揮著重要作用:一部分miRNA可能促進細胞的增殖與分化，另一部分miRNA可能促進細胞的凋亡，加重組織的損傷。隨著目前科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的miRNA將不斷被發(fā)現(xiàn)，哪種miRNA在I/R過程中發(fā)揮哪種作用也會得以明確。相信在不久的將來，miRNA可能是早期診斷與治療I/R及其他相關(guān)疾病的非常有效的新靶點之一。

［1］ Lee RC，F(xiàn)einbanum RL，Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-4［J］.Cell，1993，75(5):843-854.

［2］ Reinhart BJ，Slack FJ，Basson M，et al.The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans［J］.Nature，2000，403(6772):901-906.

［3］ 李海明，施南峰.miRNA——一種新的調(diào)控基因表達的小分子RNA［J］.中國癌癥雜志，2006，16(8):675-678.

［4］ 王菲菲，劉新光，梁念慈.微小RNA:一類新的調(diào)控性非編碼RNA［J］.國外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊，2005，26(11):788-791.

［5］ Lee Y，Ahn C，Han J，et al.The nucleal RNase Ⅲ Drosha initiates microRNA processing［J］.Nature，2003，425(6956):415-419.

［6］ Khvorova A，Reynolds A，Jayasena SD.Funcional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias［J］.Cell，2003，115(2):209-216.

［7］ Hutvágner G，Zamore PD.A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex［J］.Science，2002，297(5589):2056-2060.

［8］ Wu L，F(xiàn)an J，Belasco JG.MicroRNAs direct rapid deadenylafion of mRNA［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103(11):4034-4039.

［9］ 戚鵬，韓金祥，魯艷芹.皰疹病毒編碼的miRNAs的研究進展［J］.中國生物工程雜志，2006，26(10):69-74.

［10］ Lagos-Quintata M，Rauhut R，Lendeckel W，et al.Identification of novel genes coding for small expressed RNAs［J］.Science，2001，294(5543):853-858.

［11］ Ambros V，Bartel B，Bartel DP，et al.A uniform system for microRNA annotation［J］.RNA，2003，9(3):277-279.

［12］ Brennecke J，Hipfner DR，Stark A，et al.Bantam encodes a developmentally regulated microRNA that controls cell Proliferation and regulates the proapoptotic gene hid in Drosophila［J］.Cell，2003，113(1):25-36.

［13］ Chan JA，Krichevsky AM，Kosik KS.MiRNA-21 is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells［J］.Cancer Res，2005，65(14):6029-6033.

［14］ Cimmino A，Calin GA，F(xiàn)abbri M，et al.miRNA-15 and miRNA-16 induce apoptosis by targeting BCL2［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102(39):13944-13949.

［15］ Alex G，Aglaia P，Antonis G，et al.Reactive oxygen species and HIF-1 signalling in cancer［J］.Cancer Letters，2008，266(1):12-20.

［16］ Ivan M，Harris AL，Martelli F，et al.Hypoxia response and microRNAs:no longer two separate worlds［J］.J Cell Mol Med，2008，12(5A):1426-1431.

［17］ Xiao C，Rajewsky K.MicroRNA control in the immune system:basic principles［J］.Cell，2009，136(1):26-36.

［18］ Baltimore D，Boldin MP，O'Connell RM，et al.MicroRNAs:new regulators of immune cell development and function［J］.Nat Immunol，2008，9(8):839-845.

［19］ Liu G，F(xiàn)riggeri A，Yang Y，et al.miR-147，a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation，regulates murine macrophage inflammatory responses［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(37):15819-15824.

［20］ O'Connell RM，Taganov KD，Boldin MP，et al.MicroRNA-155 is induced during the macrophage inflammatory response［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104(5):1604-1609.

［21］ Moschos SA，Williams AE，Perry MM，et al.Expression profiling in vivo demonstrates rapid changes in lung microRNA levels following lipopolysaceharide-induced inflammation but not in the anti-inflammatory action of glucocorticoids［J］.BMC Genomics，2007，8:240-251.

［22］ Rodriguez A，Vigorito E，Clare S，et al.Requirement of bic/microRNA-155 for normal immune function［J］.Science，2007，316(5824):608-611.

［23］ Johnnidis JB，Harris MH，Wheeker RT，et al.Regulation of progenitor cell proliferation and granulocyte function by microRNA-223［J］.Nature，2008，451(7182):1125-1129.

［24］ Perry MM，Moschos SA，Williams AE，et al.Rapid changes in microRNA-146a expression negatively regulate the IL-lbeta-induced inflammatory response in human lung alveolar epithelial cells［J］.J Immunol，2008，180(8):5689-5698.

［25］ Jeyaseelan K，Lim KY，Armugam A.MicroRNA expression in the blood and brain of rats subjected to transient focal ischemia by middle cerebral artery occlusion［J］.Stroke，2008，39(3):959-966.

［26］ Yu CH，Xu CF，Yi YM.Association of MicroRNA-223 expression with hepatic ischemia/reperfusion injury in mice［J］.Dig Dis Sci，2009，54(11):2362-2366.

［27］ Xu CF，Yu CH，Li YM.Regulation of hepatic microRNA expression in response to ischemic preconditioning following ischemia/reperfusion injury in mice［J］.OMICS，2009，13(6):513-520.

［28］ Tang Y，Zheng J，Sun Y，et al.MicroRNA-1 regulates cardiomyocyte apoptosis by targeting Bcl-2［J］.Int Heart J，2009，50(3):377-387.

［29］ Ren XP，Wu J，Wang X，et al.MicroRNA-320 is involved in the regulation of cardiac ischemia/reperfusion injury by targeting heatshock protein 20［J］.Circulation，2009，119(17):2357-2366.

［30］ 潘振偉，呂延杰，初文峰，等.缺血性心律失常相關(guān)微小RNA在大鼠心臟的表達變化［J］.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2007，41(2):95-97.

［31］ 吳鈺，劉芬，阮瓊芳，等.miRNA-92a在缺血再灌注腎損傷中的表達變化［J］.實驗與檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2010，28(1):9-11.