氨基化碳納米管的制備方法及在藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

江 麗， 李麗麗， 何 華*， 肖得力， 劉鐵兵

(1.中國(guó)藥科大學(xué)分析化學(xué)教研室，江蘇南京210009;2.中國(guó)藥科大學(xué)藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210009;3浙江科技學(xué)院中德農(nóng)產(chǎn)品加工工業(yè)研究院，浙江 杭州310023)

碳納米管(carbon nanotubes，CNTs)是由日本科學(xué)家Iijima最先發(fā)現(xiàn)的一種新型納米材料(Nature，1991年)，由于具有質(zhì)量輕、比表面積大、導(dǎo)電性好、性能穩(wěn)定、機(jī)械強(qiáng)度高等物理化學(xué)特性而備受關(guān)注，并迅速成為物理、化學(xué)、材料、生物、環(huán)境、醫(yī)藥等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［1］。CNTs具有典型的層狀中空結(jié)構(gòu)，是由許多處于芳香不定域系統(tǒng)中的碳原子組成的單層或多層石墨片卷曲而成的圓柱形殼體大分子［2］，前者稱為單壁碳納米管(single-walled carbon nanotubes，SWNTs)，后者稱為多壁碳納米管(multiwalled carbon nanotubes，MWNTs)，其管身由六邊形碳環(huán)組成，端帽部分則由五邊形的碳環(huán)構(gòu)成。由于這種獨(dú)特的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，CNTs幾乎不溶于任何溶劑，包括水和普通的有機(jī)溶劑，且在溶液中，其分子間易以較強(qiáng)的范德華力團(tuán)聚、彎曲、纏結(jié)，并聚集成束，具有毒性，這不僅妨礙了對(duì)其在分子水平上的研究，也導(dǎo)致其生物相容性差，極大地限制了它在生物、醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用［3］。然而，當(dāng)CNTs的結(jié)構(gòu)發(fā)生特定變化并攜帶某些活性基團(tuán)時(shí)，其性質(zhì)也會(huì)隨之發(fā)生相應(yīng)的變化。Coccini等［4］通過實(shí)驗(yàn)研究，比較了MWNTs、羧基化MWNTs以及氨基化MWNTs對(duì)人體A549與D384細(xì)胞的毒性作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)修飾的MWNT相比，氨基化MWNTs的溶解性與分散性均有所改善，不易聚集成團(tuán)，對(duì)細(xì)胞的毒性減小。因此，要拓展CNTs在藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，首先應(yīng)對(duì)其進(jìn)行功能化改性，以提高其溶解性與分散性，降低其毒性。

目前已報(bào)道的CNTs功能化改性方法大致可分為非共價(jià)功能化和共價(jià)功能化兩類［5］。非共價(jià)功能化主要通過修飾分子與CNTs表面的非共價(jià)物理性相互作用來實(shí)現(xiàn);共價(jià)功能化的方法則很多，包括羧基化及其衍生反應(yīng)、環(huán)加成反應(yīng)、氟化反應(yīng)、氨基化反應(yīng)、卡賓反應(yīng)等，國(guó)內(nèi)外研究者在這些方面已取得大量的研究成果［6］。氨基是生物化學(xué)中一種很重要的修飾基團(tuán)，許多化學(xué)藥物、聚合物和生物分子等都可通過酰胺鍵連接到相應(yīng)的載體上，而表面氨基化是構(gòu)建具有藥學(xué)實(shí)用價(jià)值的CNTs的重要方法之一。氨基化CNTs不僅能保持CNTs原有的良好性質(zhì)，而且還具有很好的溶解性與生物相容性以及較高的反應(yīng)活性和較低的毒性，其氨基末端可以共價(jià)鍵的形式與多種聚合物和生物活性物質(zhì)相連接，因而在藥學(xué)領(lǐng)域具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值［7］。

1 氨基化碳納米管的制備方法

CNTs的氨基化是指通過物理或化學(xué)的手段使其表面攜帶氨基，以提高其分散性、溶解性及生物相容性。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)CNTs的氨基化修飾進(jìn)行了大量的研究，開發(fā)出多種氨基化CNTs的制備方法。

1.1 酰氯化法

酸處理改性是目前較為成熟的一種CNTs功能化改性方法，即先將CNTs經(jīng)氧化性酸處理，使其表面帶有羧基，然后再通過化學(xué)反應(yīng)在羧基上連接其他所需基團(tuán)，以改善CNTs在有機(jī)溶劑中的溶解性。據(jù)此，人們將羧基化CNTs與二氯亞砜(SOCl2)反應(yīng)，生成酰氯化產(chǎn)物，再將其與小分子或長(zhǎng)鏈分子進(jìn)行酰胺化反應(yīng)，得到氨基化CNTs，這種酰氯化法已成為最為常用的氨基化 CNTs制備方法。如，Li等［8］先將MWNTs與濃硫酸和濃硝酸混合體積比為3∶1的混酸一起超聲處理并回流8 h，制得羧基化MWNTs，再將其在室溫下與SOCl2攪拌12 h，得到酰氯化產(chǎn)物，隨后將其分別與等量三亞乙基四胺和四乙烯五胺混合，于室溫下攪拌24 h，最終得到兩種不同的氨基化MWNTs。這兩種氨基化產(chǎn)物分散性均好，并保持了原始的筒狀結(jié)構(gòu)，在二甲基甲酰胺(DMF)、H2O、CH2Cl2、CHCl3中的溶解性均得到提高。Hsieh等［9］采用類似的方法將氨與酰氯化MWNTs反應(yīng)，也制得了表面連有氨基的CNTs，并將其應(yīng)用于電化學(xué)研究。結(jié)果表明，與普通的CNTs相比，這種氨基化CNTs因表面存在親水基團(tuán)與活性位點(diǎn)而具更為優(yōu)良的電化學(xué)性能。Yen等［10］通過酰氯化反應(yīng)，制備了由乙二胺修飾而得到的氨基化MWNTs，且研究發(fā)現(xiàn)，由于表面的氨基常攜帶正電荷，氨基化MWNTs具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的功能。這一發(fā)現(xiàn)為CNTs在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供了依據(jù)。

此外，利用高分子聚合物對(duì)CNTs進(jìn)行氨基化修飾或?qū)Π被疌NTs進(jìn)行修飾，也受到廣泛關(guān)注。如將氨基修飾的聚乙二醇(PEG)通過酰氯化法接枝到CNTs上，可制得水溶性良好的氨基化CNTs［11］。Zhang等［12］先用酰氯化法和己二胺修飾制得氨基化CNTs，再將其與聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)通過共價(jià)鍵結(jié)合，制得了表面包裹 PMMA的氨基化CNTs，該納米材料具有良好的力學(xué)、流變學(xué)和電學(xué)性能，其儲(chǔ)能模量(反映材料彈性的指標(biāo))和損耗模量(反映材料黏性的指標(biāo))均隨氨基含量的增大而增大。

1.2 縮合法

由于CNTs的結(jié)構(gòu)異常穩(wěn)定，不易與一般的化學(xué)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，因此，與酰氯化法相似，用縮合法制備氨基化CNTs時(shí)，也需先將CNTs進(jìn)行羧基化處理，使其表面帶有活性基團(tuán)，便于進(jìn)一步修飾。Ma等［13］先通過對(duì)CNTs進(jìn)行2小時(shí)的O3/紫外光照(UV/O3)，制得羧基化CNTs，然后將其與縮合劑二環(huán)己基碳二亞胺DCC和乙二胺在60℃條件下混合攪拌2 h，使其與乙二胺發(fā)生縮合反應(yīng)，最后經(jīng)過濾、干燥，得到氨基化CNTs。該氨基化CNTs表面所攜帶的氨基可有效抑制CNTs的團(tuán)聚，其分散性得以提高。與未功能化的CNTs相比，經(jīng)乙二胺修飾制得的氨基化CNTs與環(huán)氧樹脂結(jié)合后，其表面能可提高40%，具有較好的濕潤(rùn)性。由于羧基化CNTs表面的羧基本身具有一定的反應(yīng)活性，所以在縮合過程中即使無縮合劑存在，羧基化CNTs也能與胺發(fā)生縮合反應(yīng)，得到氨基化CNTs。Murugesan等［14］在前人研究的基礎(chǔ)上，將MWNTs及經(jīng)混酸氧化法制得的羧基化MWNTs分別與乙二胺在30℃條件下超聲混合3 h，使之充分反應(yīng)，得到了兩種不同的氨基化CNTs。研究顯示:先羧基化后再進(jìn)行縮合反應(yīng)，得到的氨基化CNTs的表面帶有更多的氨基，更具反應(yīng)活性。這說明，與直接氨基化相比，先接入羧基可使CNTs的反應(yīng)活性增強(qiáng)，更有利于隨后的氨基化修飾，是一種高效的氨基化CNTs制備方法。

1.3 微波等離子體法

經(jīng)化學(xué)方法修飾的CNTs雖然水溶性得以提高，但其原始管狀結(jié)構(gòu)可能會(huì)因化學(xué)修飾而遭破壞，其性能也會(huì)隨之受到一定程度的影響。于是，利用微波等離子體制備氨基化 CNTs的方法應(yīng)運(yùn)而生［15］。微波等離子體法的原理是，利用非聚合性氣體等離子體轟擊原始CNTs表面，引起其表面化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)CNTs的功能化改性。Chen等［16］用微波等離子體增強(qiáng)光放電光源照射NH3/Ar混合氣體，以破壞氣體分子的價(jià)鍵，產(chǎn)生活潑的氨基等離子體，用其轟擊MWNTs表面，使后者氨基化。研究發(fā)現(xiàn)，混合氣體氣流速度、輝光照射時(shí)間、微波功率以及電壓強(qiáng)度等因素均會(huì)影響MWNTs表面修飾的氨基數(shù)量，但經(jīng)等離子體處理的MWNTs其表面物理形態(tài)與管狀結(jié)構(gòu)并未受到破壞，且水分子與其接觸角由原來的70°降至45°，其親水性增強(qiáng)。Amiri等［17］報(bào)道了一種更為簡(jiǎn)便、有效的應(yīng)用微波手段制備氨基化CNTs的方法，即引入NaNO2作為重氮離子的來源，進(jìn)而引發(fā)CNTs上的自由基反應(yīng):首先將MWNTs、乙二胺與NaNO2于50℃超聲混合30 min，再在90℃條件下用功率為500W的微波處理15 min，然后將此反應(yīng)液過濾、干燥，即得到由乙二胺修飾產(chǎn)生的氨基化CNTs。

1.4 高能球磨法

高能球磨(high-energy ballmilling)法的基本原理是利用機(jī)械能來誘發(fā)化學(xué)反應(yīng)或誘導(dǎo)材料組織、結(jié)構(gòu)和性能的變化，以制備出新材料。作為一種新技術(shù)，它具有明顯降低反應(yīng)活化能、細(xì)化晶粒、提高粉末活性、改善顆粒分布均勻性、促進(jìn)固態(tài)離子擴(kuò)散、誘發(fā)低溫化學(xué)反應(yīng)等優(yōu)勢(shì)，是一種節(jié)能、高效的新材料制備技術(shù)［18］。在某些化學(xué)物質(zhì)存在的情況下，對(duì)CNTs進(jìn)行高能球磨，不僅能夠改善其分散性，而且還能在其表面引入某些功能化基團(tuán)，從而達(dá)到改性的目的。Singhal等［19］將NH4HCO33.2 g與MWNTs 0.5 g在乙醇中超聲混合3 h，干燥除去乙醇，得到NH4HCO3與MWNTs的固態(tài)混合物;隨后用直徑為10 mm、質(zhì)量為MWNTs近百倍的ZrO2研磨球，在轉(zhuǎn)速為250 r·min－1的條件下，對(duì)該固體混合物持續(xù)研磨2～4 h，再將研磨好的固體混合物置于100℃的真空干燥箱中放置24 h，以除去由NH4HCO3產(chǎn)生的殘余氣體，最終得到了目標(biāo)產(chǎn)物氨基化MWNTs。Ma等［20］采用類似方法同樣也制得了氨基化CNTs，并發(fā)現(xiàn)，與不加NH4HCO3的CNTs相比，該法制得的氨基化CNTs分散性更好，長(zhǎng)度更短，不易纏繞，且比表面積更大，吸附性能更好。

1.5 超臨界流體法

超臨界流體是指溫度及壓力均處于臨界點(diǎn)以上時(shí)的液體，其兼具氣體和液體的雙重性質(zhì)和優(yōu)點(diǎn)，如溶解性強(qiáng)、黏度低、擴(kuò)散性好、流體密度易于控制等，而超臨界流體法是一種制備新型材料的有效方法。Shao等［21］將未經(jīng)修飾的MWNTs用傳統(tǒng)酸化處理，得到羧基化MWNTs;并用在溫度為308℃、壓強(qiáng)為9.82 MPa的條件下制得的氨水超臨界流體分別處理未經(jīng)修飾的MWNTs和羧基化MWNTs，持續(xù)10 min，分別得到氨基化MWNTs－1和－2。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，氨基化MWNTs－2的含氮量為5.64%，而氨基化MWNTs－1的含氮量?jī)H為0.50%。這表明，經(jīng)酸化處理所得羧基化 MWNTs比未經(jīng)羧化的MWNTs更具反應(yīng)活性，經(jīng)超臨界流體處理后，前者表面帶有的氨基數(shù)量更多。由此推斷，氨基可能是通過CNTs表面的羧基等基團(tuán)而連接到CNTs上的。此外，超臨界氨液在致使CNTs氨基化的同時(shí)，也使CNTs的長(zhǎng)度和厚度均變小，從而減弱了其團(tuán)聚性。超臨界流體法適用于氨基化CNTs的大規(guī)模生產(chǎn)，使得氨基化CNTs的產(chǎn)業(yè)化成為可能。

1.6 其他

Wang等［22］通過化學(xué)還原法成功制備了氨基化CNTs:先用混酸處理原始CNTs，使其表面連接上硝基基團(tuán)，然后在還原劑的作用下，將硝基還原成氨基，從而得到在DMF、乙醇、丙酮等極性溶劑中溶解性良好的氨基化CNTs。Nakamura等［23］利用光化學(xué)法合成了氨基化SWNTs:將純化SWNTs的乙腈分散液置于氙燈下照射，致使乙腈經(jīng)光分解所產(chǎn)生的自由基與CNTs表面發(fā)生反應(yīng)而得到氨基CNTs。Valentini等［24］先用CF4等離子體處理SWNTs，得到具有反應(yīng)活性的氟化SWNTs，再將其分散于液態(tài)氨基丁烷(BAM)中，在室溫下超聲1 h，從而將氨基引入到SWNTs表面，制得一種氨基化SWNTs——BAM-SWNTs復(fù)合物。

2 氨基化碳納米管在藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

與原始CNTs相比，氨基化CNTs的溶解性、反應(yīng)活性和生物活性均得以提高，細(xì)胞毒性降低，且細(xì)胞穿透性及生物相容性也得到提高，為其在藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。目前，氨基化CNTs在藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究主要集中在藥物或基因載體、生物工程、DNA和疫苗轉(zhuǎn)運(yùn)及組織再生等方面，并均已取得可喜進(jìn)展［25］。

在用作藥物載體方面，氨基化CNTs有明顯的優(yōu)勢(shì)［26］。Feazell等［27］將順鉑的前體鉑(Ⅳ)復(fù)合物通過肽鍵連接到作為載體的氨基化SWNTs上，形成轉(zhuǎn)運(yùn)體，藥理實(shí)驗(yàn)顯示，通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用，這一載體可將鉑(Ⅳ)復(fù)合物帶入睪丸癌細(xì)胞，發(fā)揮抗癌作用，且連接于氨基化SWNTs表面的鉑(Ⅳ)復(fù)合物的細(xì)胞毒性是游離鉑(Ⅳ)復(fù)合物的數(shù)百倍，有利于殺滅目標(biāo)腫瘤細(xì)胞。這項(xiàng)研究成果為提高腫瘤化療藥物的療效提供了一條新途徑。Wakasugi等［28］將氨基化CNTs作為抗腫瘤藥阿霉素的載體，考察了其載藥性能及在體內(nèi)外的釋藥過程。結(jié)果顯示，制備時(shí)介質(zhì)中離子強(qiáng)度與H+濃度的增加能使氨基化CNTs的載藥量增大，而降低釋放介質(zhì)中H+濃度則能促進(jìn)其釋藥。

氨基化CNTs還可用作基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，并已展現(xiàn)出潛在應(yīng)用前景［29］。有研究顯示，氨基化CNTs在室溫下與siRNA序列共孵育后，可通過靜電吸附作用形成CNTs-siRNA復(fù)合物，這種復(fù)合物可有效下調(diào)目標(biāo)癌基因的表達(dá)，而對(duì)正常組織細(xì)胞無明顯毒性［30］。但Varkouhi等［31］制備了由聚乙烯亞胺和吡啶修飾得到的兩種氨基化CNTs，并將其分別作為siRNA的載體，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，這兩種氨基化CNTs均未能使siRNA的基因沉默率得以提高，且具有較高的細(xì)胞毒性。因此，恰當(dāng)?shù)陌被揎椃椒ㄊ侵苽涓咝o毒的CNTs基因傳遞系統(tǒng)的一個(gè)必要條件。除用作單一載體外，氨基化CNTs作為藥物與基因的復(fù)合載體的應(yīng)用研究也已成為藥學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。Sanz等［32］通過研究發(fā)現(xiàn)，與普通CNTs相比，由聚乙烯亞胺修飾得到的氨基化CNTs與抗瘧藥氯喹和DNA序列形成的復(fù)合物具有很好的基因轉(zhuǎn)運(yùn)能力，且能有效降低氯喹的毒副作用，為氨基化CNTs同時(shí)作為藥物和基因的雙重載體而用于治療提供了依據(jù)。

由于具有優(yōu)良的導(dǎo)電性能和較大的比表面積，CNTs可作為理想的電子傳遞媒介和生物大分子負(fù)載材料而應(yīng)用于生物傳感器，實(shí)現(xiàn)分子水平的快速檢測(cè)和微量分析［33］。Li等［34］用氨基化MWNTs和納米金制備了一種新型的納米級(jí)復(fù)合物，并將其作為電極用于葡萄糖生物傳感器。該傳感器對(duì)葡萄糖的響應(yīng)迅速、準(zhǔn)確，具有很強(qiáng)的分析性能和高靈敏度，其所測(cè)葡萄糖濃度的線性范圍為0～20 mmol·L－1，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.997;分別用5個(gè)該傳感器對(duì)濃度為5 mmol·L－1的葡萄糖溶液進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果的RSD值為4.8%;而用1個(gè)該傳感器連續(xù)檢測(cè)5次(每日1次)，測(cè)定結(jié)果的RSD值為1.6%。表明該傳感器檢測(cè)葡萄糖濃度的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好。Sartori等［35］基于亞硫酸鹽對(duì)多酚氧化酶具抑制作用的原理，利用氨基化MWNTs制備了檢測(cè)亞硫酸鹽含量的生物傳感器，該類傳感器的檢測(cè)限達(dá)0.4μmol·L－1，線性范圍為0.5～22μmol·L－1，響應(yīng)靈敏，操作方便，有望廣泛用于亞硫酸鹽的含量測(cè)定，從而進(jìn)一步用于食品與藥品安全性的監(jiān)測(cè)。

3 結(jié)語

經(jīng)過多年研究，人們對(duì)氨基化CNTs的結(jié)構(gòu)和性能有了更深入的了解，氨基化CNTs在藥學(xué)、材料、電子等眾多領(lǐng)域的應(yīng)用研究也都取得了突破性進(jìn)展，然而在氨基化CNTs的制備與應(yīng)用中仍存在一些需要解決的問題，如，雖然現(xiàn)在已能大量生產(chǎn)MWNTs，但是SWNTs的研制仍處于實(shí)驗(yàn)室階段;另外，目前氨基化CNTs的雜質(zhì)含量高且價(jià)格昂貴;對(duì)CNTs進(jìn)行氨基化修飾的方法雖多但還不完善，不適于大規(guī)模生產(chǎn)。因此，開發(fā)能連續(xù)批量化生產(chǎn)高質(zhì)量CNTs的方法和完善CNTs的氨基化修飾手段，將是今后氨基化CNTs制備方法研究的一項(xiàng)重要內(nèi)容。此外，雖然氨基化CNTs在藥學(xué)領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景，如可用作藥物和基因的載體，但其毒理及藥理研究尚不完備，因而離商品化還有一段距離。為此，開展全方位的動(dòng)物和人體實(shí)驗(yàn)，考察氨基化CNTs與藥物和生物分子的相互作用，確保其安全性，仍將是其應(yīng)用研究的一個(gè)重要方向。筆者所在課題組正在開展 CNTs在藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用性研究［36-40］，并采用酰胺化法成功制備了分散性良好的氨基化CNTs，考察了其作為藥物載體在體內(nèi)外的載藥特性和釋藥行為，目前正在對(duì)其生物安全性進(jìn)行考察。

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