德國蘋果病毒病分子檢測與防控技術(shù)考察報告

李元軍 周先學(xué) 趙玲玲 蘇佳明 唐美玲

山東省煙臺市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院·265500

為執(zhí)行國家外國專家局出國培訓(xùn)項(xiàng)目CG2011370012“蘋果病毒病的分子檢測與防控利用”，由山東省煙臺市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院5名科技人員組成的培訓(xùn)團(tuán)于 2011年8月20日至9月9日赴德國栽培作物聯(lián)邦研究中心(JKI）果樹及葡萄栽培植物保護(hù)研究所進(jìn)行了為期21 d的技術(shù)培訓(xùn)，期間考察了解了德國關(guān)于蘋果病毒病、蘋果植原體病害的研究新進(jìn)展，學(xué)習(xí)了蘋果莖痘病毒、蘋果花葉病毒和蘋果褪綠葉斑病毒的分子檢測技術(shù)，特別是帶病毒樣品處理、RNA提取、反轉(zhuǎn)錄PCR及凝膠成像等關(guān)鍵檢測技術(shù)與方法；還參觀了該所的果樹病毒純種保存圃與溫室，實(shí)地學(xué)習(xí)、觀察了多種蘋果病毒病在蘋果樹上的表現(xiàn)癥狀以及病毒傳播途徑。另外，還與研究所的果樹昆蟲學(xué)、植原體學(xué)、真菌學(xué)和細(xì)菌學(xué)等方面專家以及部分地區(qū)生產(chǎn)部門的技術(shù)人員進(jìn)行了座談，初步了解與學(xué)習(xí)了德國蘋果病毒病的檢測與防控技術(shù)，以及果樹生產(chǎn)與科研現(xiàn)狀，現(xiàn)將有關(guān)情況總結(jié)匯報如下。

1 研究所概況

JKI，位于德國海德堡市道森漢姆鎮(zhèn)。其主要任務(wù)是開展農(nóng)作物植物保護(hù)、產(chǎn)品評估、果樹與葡萄的病蟲害和有害生物傳播途徑、植物保護(hù)防控技術(shù)措施、抗病性優(yōu)良新品種選育等方面的研究以及果樹病蟲害的預(yù)測預(yù)報與預(yù)警機(jī)制的建立。

該所共有9個研究室，主要從事果樹細(xì)菌學(xué)、真菌學(xué)、植原體、病毒等果樹植物保護(hù)及葡萄栽培研究。其中果樹植物保護(hù)研究方面有6個研究室，分別是果樹細(xì)菌學(xué)與火疫病研究室、化學(xué)生態(tài)學(xué)與植物病理學(xué)研究室、果樹昆蟲學(xué)研究室、果樹真菌學(xué)研究室、果樹植原體研究室、果樹病毒與類病毒研究室；葡萄栽培研究方面有3個研究室，分別是葡萄真菌研究室、葡萄流行病載體研究室、葡萄昆蟲研究室；以及1個國際學(xué)員培訓(xùn)中心（大學(xué)聯(lián)合）和2個試驗(yàn)農(nóng)場。現(xiàn)有主要課題項(xiàng)目負(fù)責(zé)人14位。近10年來，先后承擔(dān)歐盟、聯(lián)邦政府和地方項(xiàng)目55項(xiàng)。在《病蟲害科學(xué)》《細(xì)菌學(xué)》《化學(xué)生態(tài)學(xué)》《作物學(xué)報》《植物病理學(xué)》《園藝學(xué)文摘》等國際知名刊物發(fā)表論文260余篇。

JKI是聯(lián)邦政府在奎德林堡建立的一個國家級權(quán)威的獨(dú)立研究機(jī)構(gòu)。JKI目前擁有1200名科研人員，其中包括300名科學(xué)家，在柏林 (Berlin and kleinmachnow)、 奎德林堡（Quedlinburg）、不倫瑞克(Braunschweig)和道森海姆(Dossenheim)等地共有15個研究所，以及信息中心、圖書館等機(jī)構(gòu)。JKI致力于研究植物遺傳、作物栽培、植物營養(yǎng)、土壤科學(xué)、植物保護(hù)和植物檢疫等栽培植物生物學(xué)的廣泛領(lǐng)域，這使得JKI在作物種植產(chǎn)業(yè)中起到了至關(guān)重要的作用。

果樹及葡萄栽培植物保護(hù)研究所隸屬于

2 蘋果病毒病和植原體病害研究

2.1 病毒病研究 早在19世紀(jì)50年代，德國已開始進(jìn)行對蘋果病毒種類的調(diào)查鑒定工作。到目前為止，德國已報道的蘋果病毒及其類似病原物有30多種。主要包括蘋果花葉病毒(APMV)、蘋果褪綠葉斑病毒(ACLSV)、蘋果莖痘病毒(ASPV)和蘋果莖溝病毒(ASGV)。關(guān)于蘋果病毒病的檢測，由于指示植物法所需檢測時間長，而酶聯(lián)免疫法存在假陽性率高等缺點(diǎn)，目前德國主要應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)。該方法敏感性和特異性都大大增強(qiáng)，并且很適合大量樣品的快速檢測。此外他們還發(fā)展了多重RT-PCR，實(shí)現(xiàn)了在一個反應(yīng)體系中不但可以對一種類病毒核酸進(jìn)行擴(kuò)增，而且可以同時對多種類病毒核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增，此法在檢測果樹病毒復(fù)合侵染時很有效，且省時省力。利用RT-PCR方法檢測和鑒定果樹病毒，最重要的一個步驟是RNA的提取。關(guān)于植物總RNA的提取，最常用的方法是CTAB法和二氧化硅吸附法。目前在德國最常用的方法是二氧化硅吸附法，與CTAB法相比，該方法操作簡單，RNA穩(wěn)定性好，常溫操作，不需對提取藥劑進(jìn)行特殊處理。所需時間短，1 h即可完成整個提取過程。提取完成后，利用RT-PCR技術(shù)鑒定病毒的種類，必要時進(jìn)行序列測定。對于獲得的新的果樹病毒他們一般接種到指示植物進(jìn)行生物學(xué)鑒定，以確定該病毒在果樹上的表現(xiàn)癥狀，用于該病毒的田間診斷。所謂指示植物，是指對某種或幾種病毒及類似病原物或株系具有敏感反應(yīng)并表現(xiàn)明顯癥狀的植物。由于所有果樹病毒都可通過嫁接傳染,所以可以通過嫁接，使病毒從待檢植物傳到指示植物。在德國生產(chǎn)上常用的指示植物有：弗吉尼亞小蘋果(Virginia Crab)、司派227 (Spv227)、光輝 (Radiant)和蘇俄蘋果(R12740～7A)。其中，弗吉尼亞小蘋果可檢測莖痘病毒和莖溝病毒；司派227和光輝可檢測莖痘病毒；蘇俄蘋果可檢測褪綠葉斑病毒。指示植物鑒定法可在大田或溫室進(jìn)行，也可采用試管嫁接方法在超凈工作臺上進(jìn)行。關(guān)于蘋果病毒病的接種方法，德國研究學(xué)者主要應(yīng)用摩擦接種和農(nóng)桿菌侵染接種兩種方法。所謂摩擦接種果樹病毒，是將果樹病毒的提取液滴于健康植物的表面，利用摩擦方法造成的傷口以接種果樹病毒的方法。該方法操作簡單，轉(zhuǎn)染成功率一般在75%左右，其缺點(diǎn)是需要對大量的轉(zhuǎn)染植株進(jìn)行鑒定。另一種接種果樹病毒的方法是農(nóng)桿菌侵染接種法，該方法的操作步驟是首先利用RT-PCR技術(shù)克隆病毒的全長，構(gòu)建該病毒的表達(dá)載體，最后利用農(nóng)桿菌侵染的方法將病毒轉(zhuǎn)化進(jìn)受體植物。該方法的操作過程比較復(fù)雜，但是對于新發(fā)現(xiàn)的一些果樹病毒，主要利用該方法進(jìn)行接種鑒定。關(guān)于蘋果病毒病的保存，德國主要將帶有果樹病毒的材料應(yīng)用嫁接保存。

2.2 植原體病害研究 果樹植原體病害是一種非常重要的細(xì)菌病害，果樹得病后能引起黃化、叢枝，發(fā)病嚴(yán)重的能引起果樹的死亡。該病由昆蟲進(jìn)行傳播。由于目前世界上關(guān)于該病的代謝途徑和病原菌與寄主植物的互作研究甚少，因此JKI關(guān)于該病的研究主要集中在對該病的檢測、診斷、新病原菌發(fā)掘、寄主植物與病原菌的互作研究等方面。目前，德國對該病的防治方法研究主要集中在抗病新砧木的培育上，他們對抗病砧木的選育目標(biāo)是選育出抗病性強(qiáng)、矮化的新型砧木。目前該所已選育出30多個抗病性強(qiáng)砧木，其中有2個砧木已經(jīng)在意大利等國家進(jìn)行區(qū)域性試驗(yàn)。

3 蘋果病毒脫毒技術(shù)研究

因?yàn)樘O果病毒是通過嫁接傳染，一旦傳染上病毒，無有效藥劑防治。所以德國果樹病毒病的防治，主要通過栽培無病毒和抗病毒或耐病毒的品種。而采用無病毒苗木，是防治蘋果病毒病的最有效也是最根本的途徑。目前德國主要采用熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)的方法獲得無病毒材料。其具體做法是：首先將植株在27～35℃預(yù)處理 1周，以增加其存活力，然后將蘋果苗置于34～36℃環(huán)境中生長3～4周，去除蘋果病毒。熱處理結(jié)束后，剝?nèi)? mm左右的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，然后通過檢測獲得無病毒的果樹材料。由于熱處理可脫除褪綠葉斑病毒、莖痘病毒，而莖尖培養(yǎng)易脫除莖溝病毒。所以將熱處理和莖尖培養(yǎng)相結(jié)合，可以使兩種方法互補(bǔ)，提高脫毒率，而且省去了熱處理后嫩梢嫁接環(huán)節(jié)，莖尖大小可切到1 mm，易分化出苗，可減少變異后代的發(fā)生率。該方法的脫毒率可達(dá)50%～83.3%。熱處理的材料一般分盆栽苗與組培苗兩種，熱處理方式可分為恒溫與晝夜高低變溫兩種。為了避免對植株的傷害，組培苗脫毒可用晝夜高低變溫方式。目前，該方法是德國研究人員普遍應(yīng)用的脫毒技術(shù)。

此外，德國研究人員還利用在果園中選擇健壯、豐產(chǎn)的植株及新育成的品種（品系）進(jìn)行病毒鑒定，確認(rèn)無病毒后，培育成母本樹，以及直接從國外引進(jìn)無病毒品種接穗，培育成母本樹；以及采用病毒抑制劑結(jié)合莖尖培養(yǎng)等方法獲得無病毒植株。目前，德國已經(jīng)獲得了225個脫毒的果樹品種或品系。實(shí)現(xiàn)了對所有推廣果樹品種的脫毒處理，生產(chǎn)上實(shí)現(xiàn)了無毒化栽培。

4 德國病蟲害防控技術(shù)研究

德國生物防控中心于1970年組建，隸屬于德國作物研究中心（JKI）。目前該中心擁有職工55人，其中15個科學(xué)家，8個博士生，40個試驗(yàn)工人。其主要以蟲害研究為主，注重生物防控技術(shù)和產(chǎn)品的研發(fā)。主要應(yīng)用的生物防控手段包括以真菌、細(xì)菌、病毒、殺蟲燈、天敵等抑制果樹病蟲害的發(fā)展。近來，該中心研制了一種昆蟲病毒制劑，在謝花后噴灑可有效防治蘋小食心蟲，在德國已推廣200多hm2。他們還利用植物提取物防治果樹的真菌病害，他們在甘蔗中提取了一種多酚類活性物質(zhì)，該物質(zhì)不僅能殺死病菌芽孢，還能誘導(dǎo)目標(biāo)植物產(chǎn)生抗性物質(zhì)，對防治果樹一些真菌病害非常有效，目前正在進(jìn)行大田試驗(yàn)。

5 赴德國學(xué)習(xí)考察的感想與建議

5.1 針對煙臺市果樹病毒病的發(fā)生現(xiàn)狀，長期不斷地開展果樹病毒研究工作 病 毒 病是危害果樹的最重要的病害之一，果樹病毒病一旦發(fā)生，將給果樹生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前世界上對果樹病毒病沒有有效的防治方法。栽植無毒苗木是防治果樹病毒病的唯一途徑。德國政府對果樹病毒病十分重視，德國的果樹生產(chǎn)已經(jīng)于上世紀(jì)90年代全部實(shí)現(xiàn)無毒化栽培。而我國果樹無毒化苗木計劃始于20世紀(jì)90年代，經(jīng)過十幾年的發(fā)展，目前栽植無毒苗木的果園僅在3%左右。據(jù)調(diào)查，煙臺市蘋果園的果樹病毒病的帶毒率已高達(dá)60%以上，病毒病給我市帶來的經(jīng)濟(jì)損失是巨大的。上世紀(jì)90年代中期，我市科研單位開始開展蘋果病毒病的研究，由于種種原因，進(jìn)展一直非常緩慢。直到最近幾年，才又重新開始蘋果病毒病研究和脫毒工作。而且我們現(xiàn)在開始的研究工作僅限于果樹品種的脫毒和檢測等基礎(chǔ)性工作，而德國的果樹病毒研究重點(diǎn)已經(jīng)轉(zhuǎn)入病毒的致病機(jī)理、病毒與寄主植物的互作等研究領(lǐng)域，我國的果樹病毒研究工作與德國相比還存在很大的差距。因此，對果樹病毒病的研究，應(yīng)長期不間斷的持續(xù)開展。

5.2 進(jìn)一步加強(qiáng)果樹病毒病研究的國際間科技合作 目前，果樹病毒病的研究是一項(xiàng)全球化共同研究的課題。我國的果樹病毒病研究與西方發(fā)達(dá)國家相比，還存在較大差距。我們應(yīng)該按照“請進(jìn)來與走出去”相結(jié)合的思路，開展果樹病毒病基礎(chǔ)研究、無病毒果樹新品種的引進(jìn)、病毒病的防控等果樹病毒病相關(guān)研究的國際間科技合作。同時，利用國外先進(jìn)的果樹病毒病研究的最新成果，解決我國果園的病毒病問題。

此外，培訓(xùn)團(tuán)從德國引進(jìn)了部分性狀優(yōu)良的蘋果、梨、葡萄等優(yōu)良品種和砧木資源，豐富了我國的果樹種質(zhì)資源。通過學(xué)習(xí)，對德國果樹病毒病的研究現(xiàn)狀、最新的研究手段和方法、果樹育種和生產(chǎn)科研現(xiàn)狀，有了較為細(xì)致的了解。與德國作物研究中心植物保護(hù)和葡萄栽培研究所建立了良好的友好合作關(guān)系，拓寬了科研合作的范圍，而且雙方共同申報了中德政府間科技合作項(xiàng)目，為今后互派人員進(jìn)行果樹交流合作，加強(qiáng)國際間的合作與交流奠定了基礎(chǔ)。這些國際合作和交流將極大地提升我國特別是煙臺地區(qū)病毒病科研水平。