環(huán)磷酰胺對(duì)兒童系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血淋巴細(xì)胞亞群變化的影響

劉 濤，趙 令，張彥東，王 凱，馬 寧，姜振宇

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，吉林 長(zhǎng)春130021）

環(huán)磷酰胺對(duì)兒童系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血淋巴細(xì)胞亞群變化的影響

劉 濤，趙 令，張彥東，王 凱，馬 寧，姜振宇

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，吉林 長(zhǎng)春130021）

目的：探討環(huán)磷酰胺對(duì)兒童系統(tǒng)性紅斑狼瘡 （SLE）患者外周血淋巴細(xì)胞亞群變化的影響，為治療兒童SLE提供依據(jù)。方法：選取30例兒童SLE患者和30例健康兒童，檢測(cè)其外周血T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷 （NK）細(xì)胞和自然殺傷T（NKT）細(xì)胞水平。將SLE患者分為單純激素治療組和環(huán)磷酰胺聯(lián)合激素治療組，每組各15例，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)2組治療前后兒童外周血淋巴細(xì)胞亞群比率的變化。結(jié)果：與健康對(duì)照組比較，SLE患兒組CD3＋CD4＋Th細(xì)胞比率明顯降低 （P＜0.05）；CD3＋CD8＋Tc細(xì)胞比率明顯升高 （P＜0.05）；CD3－（CD16CD56）＋NK和CD3＋（CD16CD56）＋NKT細(xì)胞比率明顯降低 （P＜0.05），而CD3－CD19＋B細(xì)胞比率明顯增高 （P＜0.01）。兒童SLE患者外周血CD3＋CD8＋Tc細(xì)胞比率與SLE活動(dòng)指數(shù) （SLE DAI）呈正相關(guān)關(guān)系 （r＝0.754 7，P＜0.01）；CD3－CD19＋B細(xì)胞比率與SLEDAI亦呈明顯的正相關(guān)關(guān)系 （r＝0.158 6，P＝0.029 3）；Th、NK和NKT細(xì)胞比率與SLE DAI無(wú)明顯相關(guān)性 （P＞0.05）。與治療前比較，單用激素治療組患者治療后B細(xì)胞比率明顯降低 （P＜0.05）；NK、NKT和Th細(xì)胞比率均有所升高，Tc細(xì)胞比率降低但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。環(huán)磷酰胺聯(lián)合激素組治療后患者B細(xì)胞比率較治療前明顯降低 （P＜0.01），NK細(xì)胞、Th細(xì)胞比率較治療前明顯升高 （均P＜0.01）。結(jié)論：兒童SLE患者淋巴細(xì)胞亞群比例的失調(diào)與SLE的發(fā)病有關(guān)，環(huán)磷酰胺聯(lián)合激素治療兒童SLE效果較好。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡；環(huán)磷酰胺；淋巴細(xì)胞亞群；兒童

與成人比較，兒童系統(tǒng)性紅斑狼瘡 （systemic lupus erythematosus，SLE）臨床表現(xiàn)更加復(fù)雜多樣，癥狀較重，治療存在難度，病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚。普遍認(rèn)為：T、B細(xì)胞在SLE的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，且自然殺傷 （natural killer，NK）細(xì)胞和自然殺傷T （natural killer T，NKT）細(xì)胞亦與SLE發(fā)病密切相關(guān)。環(huán)磷酰胺是臨床常用的免疫抑制劑，可以抑制體液和細(xì)胞免疫而起到治療SLE的作用。研究［1］證實(shí)：環(huán)磷酰胺可影響不同的T細(xì)胞亞群，導(dǎo)致CD4＋／CD8＋比值變化，并可抑制B細(xì)胞的產(chǎn)生，從而減少自身抗體的數(shù)量。但目前關(guān)于環(huán)磷酰胺對(duì)兒童SLE患者淋巴細(xì)胞亞群的影響研究較少。本研究旨在探討環(huán)磷酰胺對(duì)兒童SLE患者外周血淋巴細(xì)胞亞群的影響及其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年1月—2012年1月本院兒童SLE患者 （≤16歲）30例，男性2例，女性28例，平均年齡 （10.0±4.2）歲；SLE活動(dòng)指數(shù) （SLE DAI）為3～35，平均為13；抗－雙鏈DNA陽(yáng)性率為80%，補(bǔ)體C3為0.48（0.30～0.91），補(bǔ)體C4為0.10（0.03～0.19）。30例患者隨機(jī)分為單純激素治療組和環(huán)磷酰胺聯(lián)合激素治療組，每組15例。單純激素治療組患者給予潑尼松龍1mg·kg－1·d－1靜點(diǎn)，環(huán)磷酰胺聯(lián)合激素治療組患者給予環(huán)磷酰胺每周0.4g、聯(lián)合1.0mg·kg－1·d－1潑尼松龍，治療4周。所有患者診斷均符合1997年美國(guó)風(fēng)濕學(xué)會(huì) （ACR）修訂的SLE分類診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］。疾病活動(dòng)指數(shù)參照SLE DAI評(píng)分，分?jǐn)?shù)≥6為疾病活動(dòng)期。所有患者均為初發(fā)SLE，排除系統(tǒng)性硬化、肌炎或其他自身免疫疾病，或過去的6個(gè)月已經(jīng)給予免疫抑制劑或糖皮質(zhì)激素治療的SLE患者。在門診選取30例健康兒童作為健康對(duì)照組，男性2例，女性28例，平均年齡 （11±3）歲，各組兒童年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。

1.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組兒童外周血淋巴細(xì)胞亞群比例 每個(gè)兒童采集150μL血液，平均分配至3個(gè)采樣管中。第1個(gè)采樣管中加入異硫氰酸熒光素 （fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）耦聯(lián)CD4單克隆抗體、多甲藻黃素－葉綠素－蛋白質(zhì)復(fù)合物（peridinin－chlorophyll－protein complex，PerCP）耦聯(lián)CD3單克隆抗體和聚乙烯 （polyethylene，PE）耦聯(lián)CD8單克隆抗體各5μL；第2個(gè)采樣管中加入FITC耦聯(lián)CD3單克隆抗體和PE耦聯(lián)CD19抗體各5μL；第3個(gè)采樣管中加入FITC耦聯(lián)CD3單克隆抗體和PE耦聯(lián)CD16CD56單克隆抗體各5μL。樣本在室溫下放置0.5h后，加入FACS紅細(xì)胞裂解液 （美國(guó)BD公司產(chǎn)品），靜置6min。用PBS緩沖液洗2次，應(yīng)用流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)分析軟件 （v5.7.2）分析各組兒童淋巴細(xì)胞亞群比率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。各組兒童外周血各淋巴細(xì)胞亞群比率以±s表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。淋巴細(xì)胞亞群比率與SLE DAI的相關(guān)性分析采用等級(jí)相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組兒童外周血各淋巴細(xì)胞亞群的變化 兒童SLE患者CD3＋CD4＋Th細(xì)胞比率 （26.930%±1.682%）明 顯 低 于 健 康 對(duì) 照 組 （38.420% ±1.301%） （P＜0.01）；而患兒CD3＋CD8＋Tc細(xì)胞比率 （32.590%±2.096%）較健康對(duì)照組患兒（19.570%±1.155%）明顯升高 （P＜0.01）；兒童SLE患者CD4＋／CD8＋比值顯著下降；兒童SLE患 者 CD3－（CD16CD56）＋NK 細(xì) 胞 比 率（5.606%±0.348%）、CD3＋（CD16CD56）＋NKT細(xì)胞比率 （0.973%±0.091%）較健康對(duì)照組［（14.550%±0.482%）、（4.433%±0.284%）］明顯降低 （P＜0.01）；而患兒CD3－CD19＋B細(xì)胞比率 （15.300%±1.644%）較健康對(duì)照組兒童（7.406%±0.457%）明顯增高 （P＜0.01）。見圖1。

圖1 SLE組與健康對(duì)照組兒童各淋巴細(xì)胞亞群比率Fig.1 The ratios of lymphocyte subsets of children in SLE and health control groupsA：Th cells；B：Ts cells；C：NK cells；D：NKT cells；E：B cells.

2.2 兒童SLE外周血淋巴細(xì)胞亞群比率與SLE DAI的相關(guān)性分析 兒童SLE患者外周血CD3＋CD8＋Tc細(xì)胞比率與SLE DAI呈正相關(guān)關(guān)系 （r＝0.754 7，P＜0.01）。CD3－CD19＋B細(xì)胞比率與SLE DAI亦呈明顯的正相關(guān)關(guān)系 （r＝0.159，P＝0.029，）。Th （r＝0.256，P＝0.625）、NK （r＝0.458，P＝0.089）、NKT （r＝0.574，P＝0.376，）細(xì)胞比率與SLEDAI有明顯相關(guān)性。

2.3 各組患者外周血淋巴細(xì)胞亞群比率 單用激素治療組治療后患者B細(xì)胞比率 （10.180%±1.360%）較治療前 （16.400%±2.171%）明顯降低 （P＜0.05）；NK細(xì)胞比率 （8.741%±0.462%）、NKT細(xì)胞比率 （1.375%±0.028%）和Th細(xì)胞比率 （30.250%±0.987%）均較治療前 （5.587%±0.198%）、 （0.987%±0.123%）和 （23.540±1.225%）升高，Tc細(xì)胞比率治療后 （30.120%±1.547%）較治療前 （33.710%±2.581%）降低，但治療前后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。環(huán)磷酰胺聯(lián)合激素組患者治療后CD3＋CD4＋Th細(xì)胞比率 （40.620%±1.118%）、CD3－（CD16CD56）＋NK細(xì)胞比率 （14.380%±0.665%）較治療前（26.460%±2.886%）、（5.807%±0.501%）明顯升高 （P＜0.01）。CD3－CD19＋B 細(xì) 胞 比 率（6.934% ±0.651%） 較 治 療 前 （14.200% ±2.514%）明顯降低 （P＜0.01）。見圖2。

圖2 治療4周后單用激素組與環(huán)磷酰胺聯(lián)合激素組SLE患兒B、Th和NK細(xì)胞比率Fig.2 The ratios of B，Th and NK cells of SLE patients in hormone therapy group and cyclophosphamide combined with hormone therapy group 4weeks after treatmentA：Hormone therapy group；B－D：Cyclophosphamide combined with hormone therapy group；A，B：B cells；C：Tc cells；D：NK cells.

3 討 論

兒童SLE是兒童常見的、嚴(yán)重的自身免疫性疾病，T細(xì)胞亞群的紊亂可能在疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，而CD4＋T細(xì)胞與CD8＋T細(xì)胞的相互制約與平衡對(duì)機(jī)體免疫應(yīng)答具有重要的調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示：兒童SLE患者中CD8＋T細(xì)胞較健康組明顯升高，CD4＋T細(xì)胞明顯降低，CD4＋／CD8＋比值顯著下降。而既往研究［3－4］顯示：SLE患者中CD4＋T細(xì)胞增多或CD8＋T細(xì)胞減少、CD4＋／CD8＋比例異常，因此認(rèn)為SLE的發(fā)病是由于CD8＋T細(xì)胞亞群的減少、功能缺陷所致的B細(xì)胞多克隆抗體激活和體液免疫異常所致。但也有研究［5］顯示：大部分SLE患者外周血中CD8＋T細(xì)胞數(shù)量未見降低，尤以具有反抑制活性的CD8＋T細(xì)胞高表達(dá)最為明顯，因此不能發(fā)揮CD8＋T細(xì)胞對(duì)于CD4＋T細(xì)胞的抑制作用，同時(shí)由于CD4＋T細(xì)胞的減少，尤其是具有抑制誘導(dǎo)作用的T細(xì)胞的減少，不能誘導(dǎo)CD8＋T對(duì)B細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用［6－7］，因此SLE患者雖有CD4＋T減少，CD8＋T正常或稍高，但仍表現(xiàn)為體液免疫亢進(jìn)，B細(xì)胞增殖并產(chǎn)生大量自身抗體。B細(xì)胞的功能異常在SLE的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。本研究結(jié)果顯示：兒童SLE患者中B細(xì)胞比率較健康對(duì)照組明顯升高。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為：B細(xì)胞在SLE的發(fā)病過程中是抗體依賴性的，但新近有研究［8］顯示：B細(xì)胞的抗原提呈、激活T細(xì)胞并促進(jìn)其分化、調(diào)節(jié)樹突細(xì)胞等功能異常，可能在SLE的發(fā)病過程中起更為重要的作用。

NK細(xì)胞作為天然免疫系統(tǒng)的一部分，不僅具有自然殺傷功能，對(duì)腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞有較強(qiáng)殺傷作用，而且對(duì)體內(nèi)多種細(xì)胞，尤其是T、B細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示：SLE患者NK細(xì)胞數(shù)量明顯降低，與此前的研究［9－10］結(jié)果相似，治療后NK細(xì)胞較治療前升高，提示NK細(xì)胞的變化可以直接地反映機(jī)體的免疫失衡狀態(tài)。有研究［11－12］顯示：體內(nèi)較高水平的循環(huán)免疫復(fù)合物可能是導(dǎo)致NK細(xì)胞數(shù)量減少和細(xì)胞毒作用低下的重要原因。NKT細(xì)胞是一種特殊類型的T細(xì)胞，同時(shí)表達(dá)NK細(xì)胞和T細(xì)胞標(biāo)記，是獲得性免疫和天然免疫連接的橋梁。近年來(lái)，有文獻(xiàn)［13－14］報(bào)道：NKT細(xì)胞數(shù)量的減少和功能缺陷與SLE的發(fā)病有關(guān)，但具體作用仍需進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示：SLE患者NKT細(xì)胞比率明顯降低，與文獻(xiàn)［13－14］報(bào)道結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示：淋巴細(xì)胞各亞群比率與SLE DAI有相關(guān)關(guān)系，T細(xì)胞亞群、B細(xì)胞和NK細(xì)胞的改變?cè)赟LE的發(fā)病中起重要作用，故檢測(cè)SLE患者外周血淋巴細(xì)胞亞群可了解機(jī)體的免疫狀態(tài)，對(duì)正確判斷病情和指導(dǎo)臨床治療有重要意義。

由于大多數(shù)的SLE患兒均累及內(nèi)臟，而且病情變化較快，所以大部分患兒需以激素作為首選治療藥物。糖皮質(zhì)激素對(duì)免疫細(xì)胞的許多功能以及免疫反應(yīng)的各個(gè)環(huán)節(jié)均有明顯的抑制作用，尤其對(duì)細(xì)胞免疫的作用突出；大劑量應(yīng)用激素時(shí)還可明顯抑制體液免疫反應(yīng)，減少抗體產(chǎn)生；超大劑量應(yīng)用激素則有直接的淋巴細(xì)胞溶解作用。本研究結(jié)果顯示：?jiǎn)斡眉に?周后，B細(xì)胞比率明顯降低，NK、NKT和Th細(xì)胞比率均較治療前升高，Tc細(xì)胞比率較治療前降低，但兩組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是因?yàn)闃颖玖坎蛔愫蜁r(shí)間有限所致。環(huán)磷酰胺可以影響T細(xì)胞亞群，造成CD4＋／CD8＋比值改變，同時(shí)還可以抑制B細(xì)胞的生成和抗體數(shù)量減少，是治療重癥SLE的有效藥物，特別是針對(duì)狼瘡性腎炎患者。本研究結(jié)果顯示：環(huán)磷酰胺聯(lián)合激素治療4周后，Th細(xì)胞比率較治療前明顯升高，超過基線水平，十分接近健康對(duì)照組水平，B細(xì)胞比率較治療前明顯降低；另外治療后NK細(xì)胞比率較治療前也有所升高，治療前后細(xì)胞比率的變化均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而單用激素組治療患者，與治療前比較，僅B細(xì)胞比率的降低差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他細(xì)胞并未發(fā)生具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變化。本研究結(jié)果表明：激素和環(huán)磷酰胺均可以引起T細(xì)胞亞群的變化，環(huán)磷酰胺聯(lián)合激素治療SLE的效果明顯優(yōu)于單用激素。

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Effects of cyclophosphamide on changes of lymphocyte subsets in peripheral blood of children patients with systematic lupus erythematosus

LIU Tao，ZHAO Ling，ZHANG Yan－dong，WANG Kai，MA Ning，JIANG Zhen－yu
（Department of Rheumatology，F(xiàn)irst Hospital，Jilin University，Changchun 130021，China）

ObjectiveTo explore the effect of cyclophosphamide on changes of lymphocyte subsets in peripheral blood of children patients with systematic lupus erythematosus（SLE）and to provide evidence for curing children with SLE.Methods30children with SLE and 30healthy children were selected.The levels of T cells，B cells，NK cells and NKT cells in peripheral blood were detected.The SLE patients were randomly divided into hormone therapy group （n＝15）and cyclophosphamide combined with hormone therapy group （n＝15），the changes of the levels of lymphocyte subsets in peripheral blood before and after treatment were detected by flow cytometry.ResultsCompared with healthy control group，the ratio of CD3＋CD4＋Th cells in SLE patient group was decreased obviously （P＜0.05）；the ratio of CD3＋CD8＋Tc cells was markedly increased （P＜0.05）；the ratios of CD3－（CD16CD56）＋NK and CD3＋（CD16CD56）＋NKT cells were decreased obviously （P＜0.05）；the ratio of CD3－CD19＋B cells was markedly increased（P＜0.01）.The ratio of CD3＋CD8＋Tc cells in peripheral blood of children with SLE was positively related to SLE DAI（r＝0.754 7，P＜0.01）；the ratio of CD3－CD19＋B cells was also positively related to SLE DAI（r＝0.158 6，P＝0.029 3）.The ratios of Th，NK and NKT cells were not related to SLE DAI （P＞0.05）.Compared with before treatment，the ratio of CD3－CD19＋B cells was significantly decreased after treatment in hormone therapy group （P＜0.05），and the ratios of NK，NKT and Th cells were increased and the ratio of Tc cells was decreased，but there was no significant difference（P＞0.05）.In cyclophosphamide combined with hormone therapy group，the ratio of B cells was decreased after treatment，but the ratios of NK，NKT and Th cells were increased compared with before treatment（P＜0.01）.ConclusionThe imbalanced proportion of lymphocyte subsets in the children with SLE is involved in the pathogenesis of SLE，and the treatment of cyclophosphamide combined with hormone is more effective.

systematic lupus erythematosus；cyclophosphamide；lymphocyte subset；children

R593.24

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1168－05

2012－06－29

吉林省科技廳科研基金資助課題 （201115051）

劉 濤 （1980－），男，吉林省長(zhǎng)春市人，醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事系統(tǒng)性紅斑狼瘡的研究。

姜振宇 （Tel：0431－88782060，E－mail：jlujzy＠yahoo.com.cn）