多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞形態(tài)分型與流式細(xì)胞術(shù)檢測抗原表達(dá)相關(guān)性研究

楊佳 楊波 張麗 黃艷 孫嘉峰

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是以骨髓中單克隆性漿細(xì)胞增生異常和集聚為特征的惡性腫瘤，多見于中老年人，約占造血系統(tǒng)腫瘤的10﹪[1]，經(jīng)典的MM診斷包括組織活檢、骨髓涂片檢查、X線檢測和單克隆免疫球蛋白測定等聯(lián)合方法，而沒有MM細(xì)胞表面相關(guān)抗原檢測。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測MM細(xì)胞表面相關(guān)抗原，以形態(tài)學(xué)診斷分型為基礎(chǔ)，探討兩種診斷方法的相關(guān)性，旨在為本病的診斷、治療及預(yù)后探索更有價值的方法。

對象與方法

一、對象

收集山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院2009年01月至2011年12月門診及住院的28例MM患者臨床資料，診斷依據(jù)張之南等主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[2]。其中男18例，女10例，男∶女=1.8∶1，中位年齡61歲（24～82歲）。依據(jù)血清免疫固定電泳檢查結(jié)果：IgG型12例，IgA型5例，輕鏈型4例，未分泌型4例，3例未分型。28例患者均行骨髓穿刺（bone marrow aspiration，BMA）及流式細(xì)胞術(shù)（ flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測。

二、方法

1.流式細(xì)胞分析：取患者新鮮骨髓液3ml，EDTA-K2抗凝。用流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司FC500型）通過CD45/SSC配合CD38+/CD138+設(shè)門設(shè)定待檢細(xì)胞群，分析該細(xì)胞群的抗原表達(dá)情況，檢測使用單抗包括CD138、CD38、CD56、CD19。檢測結(jié)果以抗原表達(dá)> 20﹪為陽性。

2.骨髓涂片檢測：患者BMA液涂片，室溫晾干，運(yùn)用瑞氏-姬姆薩（Wright- Giemsa's）混合染液，染色15min，水洗晾干后鏡檢,在涂片佳、染色良好、細(xì)胞分布均勻處，分類計數(shù)200個有核細(xì)胞，計算出骨髓瘤細(xì)胞的百分比。依據(jù)Greipp分型標(biāo)準(zhǔn)[3-4]，對骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)分型。

3.觀察指標(biāo)：所有病例確診時的年齡、性別、臨床表現(xiàn)、M蛋白分型、血紅蛋白、骨髓漿細(xì)胞總數(shù)、白蛋白（albumin，ALB）、血清鈣濃度(Calcium，CA)、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（Creatinine，CR）、β2微球蛋白和C反應(yīng)蛋白（C-Reactive protein，CRP）等各項結(jié)果逐一記錄進(jìn)行回顧分析。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件處理，流式抗原表達(dá)陽性數(shù)、骨髓細(xì)胞形態(tài)分型結(jié)果用相對數(shù)表示，其組間差異用卡方檢驗和秩和檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、流式細(xì)胞分析結(jié)果

28例MM患者應(yīng)用CD45/SSC配合CD38+/CD138+設(shè)門證實可疑瘤細(xì)胞比例為4.0﹪～75.4﹪。其中25例CD38（89.3﹪）表達(dá)陽性，陽性表達(dá)率均值為88.92﹪；15例患者CD56(53.6﹪)表達(dá)陽性，陽性表達(dá)率均值為68.72﹪，13例（46.4﹪）MM患者CD56不表達(dá)；CD19僅2例（7.1﹪）陽性表達(dá)；22例MM患者檢測CD138抗原，其中21例（95.5﹪）陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率均值為69.57﹪（表1）。除CD38與CD138外，各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（c2=54.343，P=0.000）。

二、MM細(xì)胞態(tài)學(xué)分型

將每例患者骨髓有核細(xì)胞增生程度按低下、活躍、明顯活躍和極度活躍劃分，分別為4例、9例、13例和2例，骨髓漿細(xì)胞比例≥30﹪的患者15例，< 30﹪患者13例。依據(jù)Greipp標(biāo)準(zhǔn)分型[3-4]，28例MM患者中，幼稚漿細(xì)胞型6例、中間漿細(xì)胞型5例、成熟漿細(xì)胞型17例。

三、抗原表達(dá)與形態(tài)學(xué)分型的關(guān)系

本組研究28例MM患者，形態(tài)學(xué)檢查骨髓瘤細(xì)胞比例在為8.0﹪～83.5﹪，流式細(xì)胞分析應(yīng)用CD45/SSC配合CD38+/CD138+設(shè)門證實可疑瘤細(xì)胞比例為4.0﹪～75.4﹪，對28例MM患者骨髓涂片漿細(xì)胞比例及流式細(xì)胞分析檢測的異常細(xì)胞群所占比例進(jìn)行分析，顯示骨髓瘤患者骨髓涂片漿細(xì)胞比例與流式細(xì)胞分析測定的異常細(xì)胞群比例之間存在差異（配對資料的秩和檢驗，Z=-4.202，P < 0.001）；且流式細(xì)胞分析的可疑瘤細(xì)胞比例低于骨髓形態(tài)計數(shù)分析的骨髓瘤細(xì)胞比例。本組研究中，將成熟和中間型骨髓瘤患者劃為一組，幼稚型骨髓瘤患者為另一分析組，發(fā)現(xiàn)以幼稚型漿細(xì)胞為主的MM患者比成熟和中間型為主的患者更容易見到CD56陽性表達(dá)（c2=4.456，P=0.035）。但 CD56是否表達(dá)與骨髓涂片漿細(xì)胞比例高低差異無統(tǒng)計學(xué)意義(c2=0.001，P=0.978，表 2）。

表1 28例MM患者流式相關(guān)抗原表達(dá)情況

四、CD抗原與實驗室檢測指標(biāo)的關(guān)系

分析研究28例患者中，CD45、CD138、CD38、CD56、CD19是否表達(dá)與臨床實驗室檢測指標(biāo)（ALB、CA、BUN、CR、β2微球蛋白、CRP）改變差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P > 0.05)。

討 論

CD138、CD38被認(rèn)為是特異性的漿細(xì)胞表面標(biāo)記，骨髓瘤細(xì)胞表面CD45不表達(dá)或弱表達(dá)，大部分骨髓瘤細(xì)胞表面有CD56高表達(dá)。CD19表達(dá)于正常漿細(xì)胞，而MM細(xì)胞不表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)免疫分型經(jīng)典方法CD45/SSC設(shè)門，檢測結(jié)果存在多種影響因素。本試驗通過CD45/SSC結(jié)合CD38+和CD138+設(shè)門來識別、分選骨髓瘤細(xì)胞，進(jìn)行抗原檢測，并結(jié)合形態(tài)學(xué)、臨床情況等，分析其相互關(guān)系。

Garcia等[5]報道CD138表達(dá)率在MM可達(dá)到100﹪，CD38在骨髓瘤細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)可以作為骨髓瘤篩選和純化標(biāo)志。本組病例檢測，CD138陽性表達(dá)21/22例（95.5﹪），陽性率均值為69.57﹪；CD38陽性表達(dá)25/28例（89.3﹪），陽性率均值為88.92﹪。與文獻(xiàn)報道基本一致。

CD56在正常成熟漿細(xì)胞上幾乎不表達(dá),但在MM細(xì)胞中表達(dá)率較高，CD56陰性不能排除骨髓瘤細(xì)胞。Seeqmiller等[6]發(fā)現(xiàn)CD56的高表達(dá)與疾病的侵襲性有關(guān)。但Sahara等[7]認(rèn)為CD56+的MM患者預(yù)后較好。CD56-患者往往伴有β2微球蛋白高和血小板計數(shù)低下容易出現(xiàn)本周蛋白陽性、腎功能不全及髓外浸潤等特點。本組研究顯示，15/28例(53.6﹪)患者CD56表達(dá)陽性，13/28例（46.4﹪）MM患者CD56不表達(dá)。其中，6例幼稚型漿細(xì)胞為主的MM患者均顯示CD56陽性表達(dá)，發(fā)現(xiàn)以幼稚型漿細(xì)胞為主的MM患者比成熟和中間型為主的患者更容易見到CD56陽性表達(dá)。結(jié)合文獻(xiàn)與本組研究結(jié)果筆者認(rèn)為，CD56在MM的診斷、治療及預(yù)后中的確有著重要的意義，但由于病例資料有限，其確切意義需進(jìn)一步研究與完善。

本組研究顯示，F(xiàn)CM測定的可疑瘤細(xì)胞比例與骨髓形態(tài)計數(shù)分析的骨髓瘤細(xì)胞比例差異的原因：（1）雖然FCM檢測使用的是單細(xì)胞懸液，有較好的均一性，分析細(xì)胞的數(shù)量大，有較高的檢出率，但該設(shè)門方法骨髓瘤細(xì)胞與有核紅細(xì)胞根據(jù)側(cè)向散射角（Side Scatter，SSC）值僅能作粗略區(qū)分，在骨髓瘤細(xì)胞比例低時易受有核紅細(xì)胞的影響，誤將其認(rèn)為骨髓瘤細(xì)胞；（2）在FCM分析中需要破除成熟紅細(xì)胞，由于漿細(xì)胞胞漿量豐富，破紅過程中會造成少量漿細(xì)胞破壞，致使FCM檢測的漿細(xì)胞比例減低；（3）骨髓涂片會因各種影響因素會造成細(xì)胞分布的不均勻，以致不同計數(shù)區(qū)域骨髓瘤細(xì)胞的比例差異較大。

FCM檢測骨髓瘤相關(guān)抗原表達(dá)情況不僅可以在部分疾?。ㄈ绶磻?yīng)性漿細(xì)胞增多癥、巨球蛋白血癥等）骨髓形態(tài)表現(xiàn)與MM相近時協(xié)助診斷，還可以從骨髓瘤的復(fù)發(fā)、髓外浸潤等多個方面來對MM患者的預(yù)后進(jìn)行全面評估，但部分抗原在預(yù)后中的意義，尚存在爭議。因此，更需要結(jié)合多方面指標(biāo)評價其對骨髓瘤預(yù)后的影響。骨髓涂片形態(tài)學(xué)檢查，可以從腫瘤負(fù)荷，細(xì)胞分化程度來揭示其對預(yù)后的意義。在臨床工作中，通過流式分析技術(shù)與骨髓形態(tài)綜合分析，可以提高判斷的準(zhǔn)確性，減少漏診和誤診。

表2 28例MM患者CD56與骨髓涂片相關(guān)檢查的分析

1 陶中飛,傅衛(wèi)軍,陳玉寶,等.206例多發(fā)性骨髓瘤預(yù)后因素分析及分期評價.癌癥,2006,25(4)：461-464.

2 張之南,沈悌.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M].2版.北京：科學(xué)出版社,1998：373-380.

3 Greipp PR,Raymond NM,Kyle RA,et al.Mutiple myeloma:Significance of plasmablastic subtype in morphological classification[J].Blood,1985,65(2):305-310.

4 Greipp PR,Leong T,Bennett JM,et al.Plasmablasticmorphology: An independent prognostic factor with clinical and laboratory correlates—Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) myeloma trial E9486 report by the ECOG Myeloma Laboratory Group[J].Blood,1998,91(7):2501-2507.

5 Garcia-SanzR,Orfao A,GonzalezM,et al.Primary plasma cell leukemia: clinical immunophenotypic,DNA ploidy and cytogenetic characteristics[J].Blood,1999，93(3):1032-1037.

6 Seeqmiller AC，Xu Y，McKenna RW，et al.Immunophenotypic differentiation between neoplastic plasma cells in mature B-Cell lymphoma vs plasma cell myeloma[J].Am J Clin Pathol，2007，127( 2): 176-181.

7 Sahara N，Takeshita A.Prognostic significance of surface markers expressed in multiple myeloma：CD56 and other antigens[J].Leuk Lymphoma，2004，45(1)：61-65.