植物乳桿菌MA2的生物學(xué)特性研究

許女，王艷萍，習(xí)傲登，張玢

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801；2.教育部天津市食品營養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

植物乳桿菌MA2的生物學(xué)特性研究

許女1，王艷萍2，*，習(xí)傲登2，張玢2

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801；2.教育部天津市食品營養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

對(duì)Kefir源植物乳桿菌MA2的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，MA2菌株在MRS培養(yǎng)基初始pH為6.60，接種量為4%，37℃厭氧條件下培養(yǎng)18 h，活菌數(shù)可達(dá)到1.2×109cfu/mL。乙酸和乳酸為發(fā)酵液中的優(yōu)勢有機(jī)酸，且厭氧條件下發(fā)酵液中的有機(jī)酸的含量較高，厭氧發(fā)酵液中檢測出的6種脂肪酸中C18:1的含量最高。降膽固醇試驗(yàn)證明，低聚葡萄糖（GOS）可以促進(jìn)MA2的膽固醇移除能力，移除率可達(dá)到70%；菌體細(xì)胞脂肪酸的測定結(jié)果顯示MA2菌株降膽固醇的機(jī)理主要是吸附、吸收同化機(jī)理。MA2菌株的牛乳發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果顯示其具有良好的產(chǎn)黏特性，在乳清培養(yǎng)基中胞外多糖產(chǎn)量可達(dá)380 mg/L。結(jié)合其良好的耐酸、耐膽鹽特性，植物乳桿菌MA2具有良好的益生菌應(yīng)用潛力。

植物乳桿菌；生物學(xué)；特性

近年來，益生菌產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，產(chǎn)品形式多樣，日本在20世紀(jì)60年代就開始使用益生菌，并較早形成了產(chǎn)業(yè)規(guī)模。美國、西歐從20世紀(jì)70年代也開始有益生菌上市[1]。而我國益生菌及其制品的研究起步比較晚，直到1992年中國微生態(tài)學(xué)會(huì)成立后，市場上才出現(xiàn)了一些益生菌產(chǎn)品[2]。益生菌產(chǎn)業(yè)在我國已經(jīng)是一個(gè)非常大的產(chǎn)業(yè)，目前市場份額已經(jīng)超過10億元人民幣，因此，篩選和開發(fā)適合我國乳品工業(yè)和益生菌制劑業(yè)發(fā)展的益生菌菌種，真正實(shí)現(xiàn)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的益生菌菌種、發(fā)酵劑、益生菌制劑及益生菌發(fā)酵乳制品的市場化，縮短與發(fā)達(dá)國家在該領(lǐng)域的差距，顯得尤為重要，這有利于我國科技創(chuàng)新體系的形成以及乳酸菌產(chǎn)業(yè)和乳品工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3]。

Kefir是一種集酸味、醇味于一體的發(fā)酵乳制品，具有獨(dú)特的營養(yǎng)價(jià)值和生理功能，在國內(nèi)外有悠久的飲用歷史[4]。Kefir粒中含有多種益生菌，是重要的益生菌資源，目前已成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。本文對(duì)從西藏Kefir粒中分離的一株植物乳桿菌MA2的生長、耐酸、耐膽鹽，降膽固醇，產(chǎn)黏等生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，進(jìn)而為開發(fā)我國具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的益生菌發(fā)酵劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

植物乳桿菌 MA2（LactobacillusplantarumMA2），分離自西藏農(nóng)家Kefir粒，已在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保存編號(hào)為CGMCC3005。

1.2 主要儀器設(shè)備

Avanti J－E型柜式冷凍離心機(jī)：Beckman Coulter US；GC-7890Ⅱ型氣相色譜儀：上海天美公司；GC-2010型氣相色譜儀：日本島津儀器公司；DZKW-C型水浴鍋：河北省黃驊儀表廠；UV-9100型紫外可見分光光度計(jì)：北京瑞利分析儀器公司。

1.3 主要試驗(yàn)方法

1.3.1 MA2菌株發(fā)酵液中有機(jī)酸和脂肪酸含量的分析

1.3.1.1 儀器與色譜條件

1）有機(jī)酸測定的儀器與色譜條件

氣相色譜儀（GC-7890Ⅱ型，上海天美公司），F(xiàn)ID檢測器。色譜柱：GDX401填充柱。溫度：進(jìn)樣器，240℃；色譜柱，200℃；檢測器，240℃。氣體流速：載氣（N2），40 mL/min；氫氣，40 mL/min；空氣，400 mL/min。進(jìn)樣量：1 μL。

2）脂肪酸測定的儀器與色譜條件

氣相色譜儀（GC-2010型，日本島津儀器公司），F(xiàn)ID檢測器。色譜柱：毛細(xì)管柱CBP 20（50 m×0.2 mm×0.2 μm）。溫度：進(jìn)樣器，280℃；色譜柱，240℃；檢測器，280℃。柱流速：0.71 mL/min。氣體流速：載氣（N2），30 mL/min；氫氣，47 mL/min；空氣，399.8 mL/min。分流比：1:10。進(jìn)樣量：1 μL。

1.3.1.2 有機(jī)酸的測定

發(fā)酵液中揮發(fā)性有機(jī)酸的測定：將MA2在MRS培養(yǎng)基中的有氧和厭氧發(fā)酵液（接種量4%，37℃，18h）離心（10000 r/min，20 min，4℃），棄菌體沉淀。取50 mL上清液濃縮至5 mL，用50%硫酸酸化至pH為2～3，供氣相分析用。發(fā)酵液中非揮發(fā)性有機(jī)酸的測定：將濃縮的5 mL乳酸菌發(fā)酵上清液加入50%硫酸2 mL，甲醇10 mL，75℃密閉反應(yīng)1 h進(jìn)行衍生處理，待冷卻后加入5 mL三氯甲烷，10 mL水。用旋渦混合器充分混勻，再以5000 r/min離心10 min，最后吸取三氯甲烷層供氣相色譜分析。

1.3.1.3 脂肪酸的測定

取50 mL乳酸菌發(fā)酵上清液濃縮至10 mL后，加入等體積三氯甲烷-甲醇抽提，有機(jī)相蒸發(fā)至干，加入4%H2SO4:CH3OH 2 mL，75 ℃密閉反應(yīng) 1 h。待冷卻后加入2 mL水，2 mL正己烷，靜置，分層。取正己烷層加入適量無水Na2SO4干燥，濾出干燥劑，濾液即為甲酯化試樣。然后用氣相色譜法分析各試樣的脂肪酸組成。

1.3.2 MA2菌株的耐酸、耐膽鹽特性研究

1.3.2.1 耐酸性實(shí)驗(yàn)[5]

將菌株MA2于MRS液體培養(yǎng)基中活化后，按體積分?jǐn)?shù)為4%的接種量分別接種于200 mL pH為2.0的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧靜置培養(yǎng)，于0、30、60、90、120 min分別取樣，采用MRS固體培養(yǎng)基進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.3.2.2 膽鹽特性實(shí)驗(yàn)[6]

將菌株MA2于MRS液體培養(yǎng)基中活化后，按體積分?jǐn)?shù)為4%的接種量接種于200 mL

含有0.3%、0.5%?；悄懰徕c的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧靜置培養(yǎng)，0、1、2、3、4 h 分別取樣，采用MRS固體培養(yǎng)基進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.3.3 膽固醇的測定方法[7]

將MA2按4%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種于含有膽固醇終濃度為30 mg/100 mL的MRS-CHO液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)，每4小時(shí)取樣，測量發(fā)酵液的OD（600 nm）值和膽固醇的降解率，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD（600 nm）值和膽固醇的降解率縱坐標(biāo)，繪制菌體的生長曲線和膽固醇移除率曲線。

采用鄰苯二甲醛比色法測上清液中的膽固醇，以未接菌的MRS-CHO液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，計(jì)算膽固醇降解率。

膽固醇的降解率＝（未接菌的MRS-CHO培養(yǎng)基中上清液中膽固醇含量—接菌的MRS-CHO培養(yǎng)基中上清液中膽固醇含量）/未接菌的MRS-CHO培養(yǎng)基中上清液中膽固醇含量×100%

1.3.4 MA2菌株產(chǎn)胞外多糖的性能測定

將MA2菌株按4%的接種量，接入適合產(chǎn)胞外多糖的乳清培養(yǎng)基[8]中，37℃下靜置厭氧培養(yǎng)24 h，將發(fā)酵液于100℃水浴30 min后，冷卻到4℃，10000 r/mim離心20 min除去菌體，吸取一定量的上清液裝入透析袋，在4℃蒸餾水中透析，期間一段時(shí)間更換蒸餾水，用苯酚硫酸法[9]檢測直至蒸餾水不出現(xiàn)紫環(huán)后，同樣以苯酚硫酸法測定透析袋內(nèi)胞外多糖含量。

1.3.5 發(fā)酵乳的黏度、乳清析出率的測定[9]

1.3.5.1 黏度的測定

美國BROOKFIELD公司，DV-Ⅲ＋型黏度計(jì)（三號(hào)轉(zhuǎn)子，100 r/min）測定發(fā)酵奶的黏度。

1.3.5.2 乳清析出率的測定

4℃冷藏期間，每4天進(jìn)行取樣測定。將50 mL凝固的酸乳小心傾入帶有120目不銹鋼絲網(wǎng)的漏斗中，收集瀝出的乳清，記錄其體積，收集時(shí)間為2 h。

2 結(jié)果與討論

2.1 植物乳桿菌MA2的生長特性

植物乳桿菌MA2的生長特性見表1。

表1 培養(yǎng)條件對(duì)菌株MA2生長的影響Table 1 Influences of incubation conditions on strain MA2 growth

表1顯示了不同的培養(yǎng)條件對(duì)菌株MA2生長的影響。結(jié)果顯示：MA2菌株在MRS培養(yǎng)基初始pH為6.60，接種量為4%，37℃厭氧條件下培養(yǎng)18 h，活菌數(shù)可達(dá)到1.2×109cfu/mL。

2.2 植物乳桿菌MA2發(fā)酵液中有機(jī)酸和脂肪酸含量的分析

按照1.3.1的方法分別對(duì)MA2菌株在有氧和厭氧發(fā)酵的情況下，發(fā)酵液中有機(jī)酸和脂肪酸的含量進(jìn)行了測定，見表2。

表2 菌株MA2發(fā)酵液中有機(jī)酸和脂肪酸的含量Table 2 Amount of organic acids and fatty acid methyl esters of strain MA2

結(jié)果顯示：乙酸和乳酸為發(fā)酵液中的優(yōu)勢有機(jī)酸，且厭氧條件下發(fā)酵液中的有機(jī)酸的含量較高，二者含量分別為36.67 mg/mL和5.01 mg/mL。另外，MA2厭氧發(fā)酵液中共檢測出 6 種脂肪酸 C14:0、C16:0、C18:0、C18:1、C18:3 和 C20:1，其中以 C18:1 的含量最高，相對(duì)含量達(dá)到30.91%。

2.3 MA2菌株的耐酸、耐膽鹽特性研究

按照1.3.2的方法測試了MA2菌株的酸和膽鹽耐受性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 菌株MA2的耐酸性和耐膽鹽特性Table 3 Tolerance to acid and bile salts of strain MA2

從表3可知，MA2菌株在pH為2的酸性培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h后，活菌數(shù)從108下降到106，顯示出較好的耐酸特性。當(dāng)培養(yǎng)基中的膽鹽添加濃度為0.3%時(shí)，MA2菌株的活菌數(shù)4 h之內(nèi)從108下降到106，下降了兩個(gè)數(shù)量級(jí)，而當(dāng)膽鹽濃度為0.5%時(shí)，活菌數(shù)則下降了3個(gè)數(shù)量級(jí)。證明MA2菌株可以抵抗較強(qiáng)的胃液的酸性（pH為2～3）環(huán)境和較高濃度的膽酸環(huán)境（膽汁濃度0.3%～0.5%），順利地到達(dá)腸道，并在腸道存活，發(fā)揮其益生功能作用。

2.4 MA2菌株的降膽固醇性能測定

2.4.1 菌體生長與降膽固醇的關(guān)系

圖1顯示了MA2菌株（接種量為4%）在MRS-CHO（膽固醇的終濃度為30 mg/100 mL）培養(yǎng)基中的生長與膽固醇移除率之間的關(guān)系。

圖1 菌株MA2在MRS-CHO中的生長曲線及膽固醇的移除率Fig.1 Growth profiles in MRS-CHO and cholesterol removal patterns for strain MA2

由圖1可知，植物乳桿菌MA2的膽固醇移除率與菌體的生長呈正相關(guān)，這與Liong[5]和Kimoto[10]等研究的結(jié)果相似。植物乳桿菌MA2在8 h～16 h即對(duì)數(shù)生長期時(shí)，膽固醇的移除速率最快，24 h時(shí)膽固醇的移除率達(dá)到55%±4.5%。

2.4.2 益生元的添加對(duì)MA2菌株降膽固醇性能的影響圖2顯示了MRS-CHO培養(yǎng)基中各種益生元的添加（終濃度為0.5%）對(duì)MA2菌株降膽固醇性能的影響，結(jié)果表明低聚葡萄糖可以顯著提高M(jìn)A2的膽固醇移除率。

圖2 益生元的添加對(duì)菌株MA2膽固醇移除率的影響Fig 2 The influence of oligosaccharides on cholesterol removal by strain MA2

菌落計(jì)數(shù)結(jié)果驗(yàn)證，相比于添加其它種類的低聚糖，低聚葡萄糖更能促進(jìn)MA2菌株在MRS-CHO培養(yǎng)基中的生長（數(shù)據(jù)未給出），進(jìn)而導(dǎo)致膽固醇的移除率提高。Perrin S et al[11]，Strobel et al[12]等報(bào)道，在體內(nèi)，益生元和益生菌聯(lián)用，一方面，由于益生元低聚糖是益生菌的最適碳源，導(dǎo)致菌體得到更多的能量，因此可以提高菌體對(duì)膽鹽的耐受性，進(jìn)而發(fā)揮其膽鹽水解酶或者吸收，同化膽固醇的作用；另一方面，在機(jī)體內(nèi)，益生元即低聚糖的添加，豐富了益生菌發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸的底物，有機(jī)酸的產(chǎn)生可以促進(jìn)腸道內(nèi)益生菌的生長；Hong Yang，F(xiàn)ang Zhang[13]等就通過響應(yīng)面的方法，體外篩選優(yōu)化合生元，來達(dá)到降低體內(nèi)降膽固醇的目的。

2.4.3 膽固醇對(duì)MA2菌株細(xì)胞脂肪酸組成的影響

為了進(jìn)一步分析研究MA2菌株的降膽固醇機(jī)理，我們測定了在培養(yǎng)基中添加膽固醇和未添加膽固醇兩種情況下，菌體細(xì)胞中脂肪酸的含量變化。由表4可知，在添加膽固醇的情況下，細(xì)胞中的 C16:1，C18:1不飽和脂肪酸的含量顯著高于未添加膽固醇的情況，說明被菌體吸附到細(xì)胞膜上和吸收進(jìn)細(xì)胞中的膽固醇，改變了菌體細(xì)胞的脂肪酸的組成。這和Kimoto[10]和Taranto[14]研究的Lactococcus lactis subsp.lactis biovar diacetylactis N7，Lactobacillus reuteri在 MRS-CHO 培養(yǎng)基中菌體細(xì)胞脂肪酸的改變情況相似，Kimoto認(rèn)為菌體細(xì)胞中脂肪酸組成的變化，是由于菌體將培養(yǎng)基中的膽固醇吸收進(jìn)細(xì)胞膜內(nèi)所引起的。另外，Liong和 Shah[5]對(duì) Lactobacillus acidophilus ATCC 33200、4356、4357、4692四株菌的降膽固醇作用的研究結(jié)果還證明，不僅添加在培養(yǎng)基中的膽固醇改變了這4株菌細(xì)胞的飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的相對(duì)組成，而且Lactobacillus acidophilus ATCC 33200和Lactoba-cillus acidophilus 4692這2株菌在添加膽固醇的情況下，細(xì)胞中的總脂肪酸的含量顯著高于未添加膽固醇的情況，Liong認(rèn)為總脂肪酸含量的升高是由被吸附和吸收進(jìn)菌體細(xì)胞中的膽固醇所引起的，并不是由菌體細(xì)胞自身合成的，因?yàn)镵iatpapan et al[15]曾經(jīng)報(bào)道，乳酸菌在高脂環(huán)境下會(huì)喪失合成脂肪酸的能力。因此，我們認(rèn)為MA2菌株是將膽固醇吸附結(jié)合在細(xì)胞膜上，進(jìn)而吸收進(jìn)細(xì)胞中，來移除培養(yǎng)基中的膽固醇，即吸收同化機(jī)理。

表4 膽固醇對(duì)MA2細(xì)胞脂肪酸組成的影響Table 4 Fatty acid composition of strain MA2 grown in the presence and absence of cholesterol

2.4.4 MA2菌株對(duì)發(fā)酵乳中膽固醇的降解作用

吸取發(fā)酵終點(diǎn)（40℃，有氧，5 h）的酸奶 10 mL，加入等體積的甲醇-三氯甲烷（2:1）混合液，混勻，離心（10000 r/min，20 min），取三氯甲烷層測定其膽固醇的含量，以發(fā)酵0 h的樣品為對(duì)照計(jì)算膽固醇的降解率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 MA2菌株對(duì)發(fā)酵乳中膽固醇的降解Table 5 Cholesterol removal of fermented milk by MA2

由表5可知，相比于發(fā)酵前的原料乳，A、B 2種發(fā)酵乳中的膽固醇含量都有所降低，但是添加了MA2菌株的發(fā)酵乳B中的膽固醇的降解率更高。

2.5 MA2菌株產(chǎn)黏特性的研究

產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌可以為酸奶提供黏度、穩(wěn)定性和保水性。多年來歐洲的各公司大力地將產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌應(yīng)用在酸奶生產(chǎn)中，可以滿足當(dāng)今消費(fèi)者對(duì)產(chǎn)品的低糖、低脂、和少放食品添加劑的要求。本文采用苯酚硫酸法測定了植物乳桿菌MA2在乳清培養(yǎng)基中產(chǎn)胞外多糖的能力，最終測得MA2在乳清培養(yǎng)基中胞外多糖的產(chǎn)量為380 mg/L。

圖3 發(fā)酵乳在冷藏期間黏度的變化Fig.3 Viscosity changes of yoghurt stored at 4℃

圖4 發(fā)酵乳在冷藏期間乳清析出率的變化Fig.4 Whey separation of yoghurt stored at 4℃

圖3和圖4描述了添加了植物乳桿菌MA2發(fā)酵劑的酸乳在4℃儲(chǔ)存期間黏度和乳清析出率的變化，結(jié)果所示，添加了植物乳桿菌MA2的發(fā)酵乳B的黏度顯著高于未添加MA2菌種的普通酸奶A，且在0～16 d內(nèi)，發(fā)酵乳B的黏度呈上升趨勢，16 d以后黏度趨于穩(wěn)定，到20 d時(shí)黏度稍微下降，可能是因?yàn)閮?chǔ)存到20 d時(shí)，酸奶的乳清析出比較多，導(dǎo)致黏度下降。而發(fā)酵乳A在0～8 d時(shí)，黏度上升較快，8 d以后黏度上升減慢，12 d時(shí)黏度趨于穩(wěn)定，到20 d時(shí)黏度稍微下降。產(chǎn)胞外多糖（EPS）的乳酸菌對(duì)提高酸乳的質(zhì)地、增加粘度、減少乳清析出，具有重要的意義；而且乳酸菌胞外多糖作為一種增稠劑[9]，安全性得到公認(rèn)，另外，乳酸菌胞外多糖還具有抗腫瘤、抗氧化、降血脂等多種生理功能。本試驗(yàn)中的植物乳桿菌MA2提高了酸奶的黏度，降低了儲(chǔ)存期間酸乳的乳清析出率，分析原因可能是因?yàn)镸A2菌株具有產(chǎn)胞外多糖的能力，具有良好的乳制品發(fā)酵劑應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)Kefir源植物乳桿菌MA2的生長特性，耐酸、耐膽鹽，降膽固醇及產(chǎn)黏等生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，結(jié)果證明，MA2菌株在MRS培養(yǎng)基初始pH為6.60，接種量為4%，37℃厭氧條件下培養(yǎng)18 h，活菌數(shù)可達(dá)到1.2×109cfu/mL；結(jié)合良好的耐酸、耐膽鹽特性及良好的牛乳發(fā)酵產(chǎn)黏特性及降膽固醇性能，使其具有良好的益生菌乳制品發(fā)酵劑應(yīng)用前景。

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Biological Characteristics of Lactobacillus plantarum MA2

XU Nü1,WANG Yan-ping2,*,XI Ao-deng2,ZHANG Bin2
（1.Food Science and Engineering College,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,Shanxi,China;2.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Ministry of Education,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China）

Biological characteristics of Lactobacillus plantarum MA2 Strain from Kefir Grains was studied in this experiment,the results showed:the concentration of strain MA2 could reach 1.2×109cfu/mL by the 18 h of anaerobic fermentation,when MRS initial pH was 6.60,inoculum was 4%,temperature was 37℃;The quantitative analysis of the organic acids and fatty acid of strain MA2 showed that acetic acid and lactic acid was the main acid in both aerobic fermentation and anaerobic fermentation broth,C18:1 was the most fatty acid in six kinds of fatty acid methyl ester detected in anaerobic fermentation broth。Additionally,glucose oligosaccharide(GOS)could improve the cholesterol removal of strain MA2,and the removal amount could might reach up to 70%;The changes of cell fatty acid composition suggested that cholesterol removal mechanism of strain MA2 was mainly binding,absorbing cholesterol into cell and assimilation.Yoghurt fermentation test showed that MA2 has a good sticky characteristics,and the EPS production could reach up to 380 mg/L in whey medium;Combined with its excellent resistance to acid and bile tolerance characteristics,strain MA2 has a good potential probiotics market.

Lactobacillus plantarum MA2;biological;characteristics

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2009BADC1B02）；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（XB2009012）

許女（1979—），女（漢），講師，博士，研究方向：益生菌及功能性乳制品的研究。

2012-03-23