α-葡萄糖苷酶抑制劑體外篩選方法的研究

朱文佳，寇自農(nóng)，張曦，付紹平，朱靖博，3，*，蕭偉

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，植物資源化學(xué)與應(yīng)用研究所，遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué)現(xiàn)代教育技術(shù)部，遼寧 大連 116034；3.中藥制藥過程新技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（籌）,江蘇 連云港 222001；4.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001）

α-葡萄糖苷酶抑制劑體外篩選方法的研究

朱文佳1，寇自農(nóng)2，張曦1，付紹平1，朱靖博1，3，*，蕭偉3，4

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，植物資源化學(xué)與應(yīng)用研究所，遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué)現(xiàn)代教育技術(shù)部，遼寧 大連 116034；3.中藥制藥過程新技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（籌）,江蘇 連云港 222001；4.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001）

以對-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷為底物，通過高效液相色譜定量分析水解產(chǎn)物對-硝基苯酚，確定α-葡萄糖苷酶的活性，建立新的α-葡萄糖苷酶抑制劑的體外篩選方法，為了提高篩選方法的靈敏度，對酶促反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，并用阿卡波糖驗(yàn)證篩選方法的可靠性，結(jié)果測得阿卡波糖的IC50為2.07 mg/mL，與文獻(xiàn)報(bào)道相近，說明該法可替代傳統(tǒng)的Trembly法，并可用于α-葡萄糖苷酶抑制劑的高通量篩選。

α-葡萄糖苷酶抑制劑；高效液相色譜；篩選模型；糖尿??；酶動力學(xué)

糖尿病（diabetes mellitus，DM）已成為嚴(yán)重威脅人類健康的主要慢性病之一[1]。糖尿病人餐后高血糖加重糖尿病并引發(fā)各種并發(fā)癥，是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。α-葡萄糖苷酶抑制劑（α-glucosidase inhibitors，α-GI）能有效控制餐后高血糖，且不導(dǎo)致低血糖[2]；另外，α-葡萄糖苷酶抑制劑還可以通過調(diào)節(jié)α-葡萄糖苷酶的活性治療病毒感染、腫瘤、溶酶體貯積癥[3]、肥胖、高三酰甘油血脂癥[4]等多種疾病。目前，臨床應(yīng)用的α-葡萄糖苷酶抑制劑都是生物合成或半合成藥，種類少、價格貴、副作用大。因此，從天然產(chǎn)物中篩選新的α-葡萄糖苷酶抑制劑成為研究的熱點(diǎn)[5]。

高通量篩選（high throughout screening，HTS）是新藥發(fā)現(xiàn)的重要步驟。目前，α-葡萄糖苷酶抑制劑體外篩選方法主要有對-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（pnitrophenyl-α-D-galactopyranoside，PNPG）法[6]、葡萄糖氧化酶法[7]和固定化酶法[8]，普遍采用分光光度法作為檢測手段，試劑消耗大、重現(xiàn)性差，尤其對于復(fù)雜樣品或有色素干擾樣品的篩選，假陽性高[9]。本研究首次利用高效液相色譜結(jié)合酶反應(yīng)動力學(xué)的原理，對反應(yīng)中酶濃度、底物濃度、終止劑用量和反應(yīng)時間等條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了α-葡萄糖苷酶抑制劑的體外篩選模型，提高了篩選的靈敏度和準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

HWS 26型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；SK-1型快速混勻器：常州國華儀器有限公司；PNS-3C型pH酸度計(jì)：上海鵬順科學(xué)儀器有限公司；Ultimate 3000高效液相色譜分析儀：美國戴安公司；微量進(jìn)樣器：寧波市鎮(zhèn)海玻璃儀器廠；1.5 mL離心管：美國Axygen公司；0.45 μm濾膜：上海密粒膜分離技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑

PNPG（純度99%）：、α-葡萄糖苷酶（純度≥10U/mg）、啤酒酵母、牛血清白蛋白（BSA，純度≥95%）：sigma公司；阿卡波糖（Acarbose，批號 AC-0808040）：湖南新匯制藥有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

參考Li[10]的方法，實(shí)驗(yàn)以PNPG為底物，通過HPLC 檢測產(chǎn)物對硝基苯酚（p-nitrophenol，PNP）的變化，確定α-葡萄糖苷酶的活性。實(shí)驗(yàn)在1.5 mL離心管中進(jìn)行，反應(yīng)總體積為 160 μL：10 μL 0.067 mol/L pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液，30 μL 0.1 U/mL α-葡萄糖苷酶，40 μL 4.0 mmol/L PNPG，振蕩混勻，37 ℃反應(yīng) 30 min，加入80 μL 0.2 mol/L的Na2CO3終止反應(yīng)，加超純水稀釋至500 μL，振蕩混勻，用0.45 μm膜過濾后上HPLC檢測。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對照（以等體積的磷酸鹽緩沖溶液代替酶液）和陽性對照（以等體積的Acarbose代替磷酸鹽緩沖溶液）。按照下式計(jì)算抑制率：

式中：A為陽性對照中PNP的濃度（扣除相應(yīng)空白，mmol/L）；B為陰性對照中PNP的濃度（扣除相應(yīng)空白，mmol/L）。

1.2.2 PNP的HPLC定量分析

色譜條件：Sino Chrom ODS-BP（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱；流動相：A為乙腈，B為含0.1%甲酸的水溶液，梯度洗脫條件為0～8min，20%～30%A；8min～13 min，30%～80%A；13 min～18 min，80%～20%A；18 min～28 min，20%A）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：常溫；檢測波長：314 nm。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：精確稱取0.0209 g PNP標(biāo)準(zhǔn)品，用磷酸鹽緩沖溶液超聲溶解，定容于25 mL容量瓶中，配置成6 mmol/L的PNP母液，將母液稀釋成0.0025、0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L。按照上述色譜條件測定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.3 酶穩(wěn)定性研究

將酶凍干粉用pH 6.8的0.067 mol/L的含0.2%BSA的磷酸鹽緩沖溶液配置成0.1 U/mL的酶液，將酶保存在冰水中，分別在 0、4、12、24、72、120、168、240 h取上述酶液按照1.2.1的方法反應(yīng)，觀察酶活性變化。

1.2.4 酶促反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.2.4.1 終止劑用量的選擇

按照 1.2.1 的方法，實(shí)驗(yàn)分別加入 10、20、40、60、80、100、120 μL Na2CO3終止反應(yīng)，觀察酶活性變化。1.2.4.2 酶濃度和反應(yīng)時間的選擇

按照1.2.4.1確定的條件，實(shí)驗(yàn)測定不同酶用量（10、20、25、30、35、40 μL）下產(chǎn)物 PNP 的變化。

1.2.4.3 反應(yīng)時間的選擇

按照1.2.4.2確定的條件，實(shí)驗(yàn)測定不同反應(yīng)時間（5、10、20、30、40、50、60 min）下產(chǎn)物 PNP 的變化。

1.2.4.4 底物濃度的選擇

按照1.2.4.3確定的條件，實(shí)驗(yàn)分別測定不同底物濃度（0.135、0.27、0.6、1.0、1.2、1.8、2.4、3.0 mmol/L）在不同時間間隔（0、3、6、9、12、15、30、90、150、210、270 min）下PNP的變化。

1.2.4.5 孵育時間的選擇

按照1.2.4.4確定的條件，實(shí)驗(yàn)分別測定α-葡萄糖苷酶與 Acarbose在一定孵育時間（5、10、15、20、30、40、50、60 min）下產(chǎn)物 PNP 的量。

1.2.5 Acarbose的IC50的測定

在1.2.4.5確定的最佳反應(yīng)條件下，測定反應(yīng)體系中不同濃度的 Acarbose（0.25、0.625、1.25、1.875、2.5、3.125、3.75、5.0、6.25、7.5、8.75 mg/mL）對 α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 PNP標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

按照1.2.2的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為y=197.4x+0.8193，R2=0.9998，說明 PNP 在 0.0025mmol/L～0.8 mmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。PNP標(biāo)準(zhǔn)工作曲線見圖1。

圖1 PNP標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.1 Working curve of PNP

2.2 溫度和pH的選擇

通常37℃時Km數(shù)量級為10-2，酶活性較大，實(shí)驗(yàn)采用人體正常體溫37℃和小腸內(nèi)α-葡萄糖苷酶的弱酸環(huán)境pH 6.8作為反應(yīng)條件。

2.3 放置時間對酶活性的影響

低濃度時α-葡萄糖苷酶亞基容易解離，而且酶容易吸附到容器壁上并容易引起表面變性[11]，實(shí)驗(yàn)加入BSA防止這種低濃度的失效。放置時間對產(chǎn)物PNP濃度的影響見圖2。

圖2 放置時間對α-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.2 Effect of the placing time on α-glucosidase activity

從圖2可以明顯看出，α-葡萄糖苷酶在冰水浴中放置240 h，水解產(chǎn)生PNP的量基本恒定，說明實(shí)驗(yàn)配制的α-葡萄糖苷酶溶液在冰水浴中放置240 h酶活穩(wěn)定。

2.4 酶促反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.4.1 終止劑濃度對酶活性的影響

為了快速、完全的終止反應(yīng)，準(zhǔn)確測量一定時間內(nèi)α-葡萄糖苷酶水解底物的量，實(shí)驗(yàn)加入一定體積的Na2CO3改變?nèi)芤簆H，使酶失活，達(dá)到終止反應(yīng)的目的。Na2CO3濃度對α-葡萄糖苷酶活性的影響見圖3。

從圖3可以看出，當(dāng)反應(yīng)體系加入10 μL～60 μL Na2CO3時，酶促反應(yīng)不能及時、完全被終止，α-葡萄糖苷酶在室溫條件下繼續(xù)水解底物，產(chǎn)物PNP的量不斷增加；當(dāng) Na2CO3的加入量達(dá)到 60 μL～120 μL 時，產(chǎn)物PNP的濃度基本不變，說明酶促反應(yīng)被終止，此時PNP的量能真實(shí)反應(yīng)酶活大小，因此實(shí)驗(yàn)選擇80 μL Na2CO3終止反應(yīng)。

圖3 終止劑對α-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.3 Effect of the terminator on α-glucosidase activity

2.4.2 酶濃度對反應(yīng)速率的影響

α-葡萄糖苷酶的濃度對產(chǎn)物PNP濃度的影響見圖4，不同酶濃度下水解產(chǎn)物PNP的HPLC圖見圖5。

圖4 α-葡萄糖苷酶濃度對水解反應(yīng)影響Fig.4 Effect of the concentration of α-glucosidase on the hydrolysis reaction

Fig.5 HPLC chromatogram of PNP with different concentration of α-glucosidase

對于酶促反應(yīng)，速度總是與酶濃度成正比[12]，隨著酶用量的增加，相同時間內(nèi)水解產(chǎn)物PNP的量隨之增加，當(dāng)加入酶量達(dá)到30 μL時，從相應(yīng)液相色譜圖（圖5）中可看到明顯的峰高的變化，因此實(shí)驗(yàn)選擇反應(yīng)酶量為 30 μL。

2.4.3 水解時間對反應(yīng)速率的影響

延長反應(yīng)時間，也可以增加產(chǎn)物的生成，如圖6所示，當(dāng)水解到30 min時，從相應(yīng)色譜圖上（圖7）可以看到明顯的峰形變化，因此實(shí)驗(yàn)選擇反應(yīng)時間為30 min。水解時間對產(chǎn)物PNP濃度的影響見圖6；不同水解時間下產(chǎn)物PNP的HPLC圖見圖7。

圖6 水解時間對水解反應(yīng)的影響Fig.6 Effect of the hydrolysis time on the hydrolysis reaction

圖7 不同水解時間下PNP的HPLC圖Fig.7 HPLC chromatogram of PNP with different hydrolysis time

2.4.4 底物濃度對反應(yīng)速率的影響

酶促反應(yīng)動力學(xué)中一般用酶促反應(yīng)的初速度量度反應(yīng)速度，為測定酶促反應(yīng)速度，實(shí)驗(yàn)首先繪制不同底物濃度下酶促反應(yīng)的過程曲線，如圖8所示。

圖8 不同底物濃度的酶促反應(yīng)過程曲線Fig.8 Curves of the enzyme-catalyzed reaction of different substrate concentrations

從圖8可以看出，反應(yīng)速度（曲線斜率）隨時間延長而減小。酶促反應(yīng)中底物向產(chǎn)物轉(zhuǎn)化低于20%時，過程曲線一般是線性的，因此實(shí)驗(yàn)用線性回歸法得到這條切線的斜率，即初速度，見表1，根據(jù)米氏方程：

但是這樣得到的K m值并不準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)利用Lineweaver-Burk作圖法對這條曲線進(jìn)行擬合[13]，繪得圖9，橫軸截距為-1/Km，因此求得K m=0.447 mmol/L≈0.4 mmol/L，實(shí)驗(yàn)選擇的底物濃度范圍為0.36 Km～8.0 Km，因此實(shí)驗(yàn)測得的K m值較準(zhǔn)確[12]。

底物濃度是影響酶促反應(yīng)的重要因素，為準(zhǔn)確、可重復(fù)的獲得α-葡萄糖苷酶的活性，首先要消除底物濃度對酶促反應(yīng)的影響。一定酶濃度下，酶促反應(yīng)首先表現(xiàn)為一級反應(yīng)；隨著底物濃度的增加，反應(yīng)最后表現(xiàn)為零級反應(yīng)，反應(yīng)速度不隨底物濃度的增加而上升，而是趨近Vmax，說明酶已經(jīng)被底物飽和。一般認(rèn)為[S]≥10 Km時，酶被底物充分飽和，反應(yīng)速度不受底物濃度影響，因此，實(shí)驗(yàn)選取底物濃度[S]=10 Km，即4.0 mmol/L為底物濃度。

表1 不同底物濃度的酶促反應(yīng)初速度Table 1 Initial velocity of enzyme-catalyzed reaction of different substrate concentrations

圖9 不同底物濃度的雙倒數(shù)圖Fig.9 Double-reciprocal of different substrate concentration

2.4.5 孵育時間對酶抑制活性的影響

抑制劑與酶結(jié)合并發(fā)揮抑制作用，往往需要一定的時間，實(shí)驗(yàn)以臨床常用的α-葡萄糖苷酶抑制劑Acarbose研究孵育時間對酶活性的影響見圖10。從圖10孵育時間對酶活性的影響中可明顯看出，孵育時間影響Acarbose對酶的抑制作用，時間過短Acarbose與酶結(jié)合不穩(wěn)定，孵育20 min后抑制率基本恒定，說明抑制劑很好的抑制了α-葡萄糖苷酶的活性，而這可能與Acarbose與酶活性中心的結(jié)合特性有關(guān)。因此實(shí)驗(yàn)選擇孵育20 min。

圖10 孵育時間對Acarbose抑制效果的影響Fig.10 Effect of the inbubation time on the inhibition rate of Acarbose

2.5 模型驗(yàn)證

Acarbose對α-葡萄糖苷酶的抑制作用具有良好的量效關(guān)系，隨著抑制劑濃度的增加，抑制率逐漸增強(qiáng)，Acarbose的濃度對酶活性的影響見圖11。

圖11 Acarbose對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Fig.11 Inhibitory effect of acarbose on α-glucosidase actibity

通過半抑制率計(jì)算軟件計(jì)算出Acarbose的IC50=2.07 mg/mL。

3 結(jié)論

研究以PNPG為底物，采用HPLC對α-葡萄糖苷酶進(jìn)行動力學(xué)分析，建立了體外篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑的方法。研究確定了α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選方法的最佳條件：10 μL 0.067 mol/L，pH6.8 的磷酸鹽緩沖溶液、30 μL 0.1 U/mL α-葡萄糖苷酶，振蕩混勻，37 ℃孵育20 min，加入40 μL 4.0 mmol/L PNPG開啟反應(yīng)，振蕩混勻，37℃反應(yīng)30 min后，加入80 μL 0.2 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，加超純水稀釋至500 μL，振蕩混勻，經(jīng)0.45 μm膜過濾后，用HPLC檢測，通過產(chǎn)物PNP的濃度變化，計(jì)算α-葡萄糖苷酶的活性。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)底物PNPG易自發(fā)水解，因此每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)置空白對照。

篩選方法經(jīng)Acarbose驗(yàn)證，確定IC50為2.07mg/mL，與文獻(xiàn)報(bào)道相近。說明該方法微量、準(zhǔn)確、靈敏、快速，可降低篩選的假陽性，提高從復(fù)雜天然產(chǎn)物提取物或復(fù)雜樣品中發(fā)現(xiàn)新的活性物質(zhì)的機(jī)率。

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Study of Screening Method for α-glucosidase Inhibitors in Vitro

ZHU Wen-jia1,KOU Zi-nong2,ZHANG Xi1,FU Shao-ping1,ZHU Jing-bo1,3,*,XIAO Wei3,4
(1.Institute of Chemistry and Applications of Plant Resources,School of Food Science and Technology,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,Liaoning,China;2.Modern Education Technology Branch,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,Liaoning,China;3.State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process,Lianyungang 222001,Jiangsu,China;4.Jiangsu Kanion Parmaceutical Co.,Ltd.,Lianyungang 222001,Jiangsu,China)

A novel screening method for α-glucosidase inhibitors has been established by HPLC in vitro.The enzymatic activities of α-glucosidase were determined by monitoring the release of PNP from the substrate PNPG..In order to improve the detection sensitivity,the conditions of enzyme-catalyzed reaction were optimized.Acarbose was used to validate the established method.The results showed that the IC50values of αglucosidase inhibitors activities of Acarbose was 2.07 mg/mL.Which was closed to the experimental date reported in literatures.So this method could be used as an alternative of traditional method of'Trembly',and it could be used in the high-throughput screening of α-glucosidase inhibitors.

α-glucosidase inhibitors;HPLC;screening model;diabetes mellitus;enzyme kinetics

中藥制藥過程新技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金課題（SKL 2010Z0201）

朱文佳（1985—），女（漢），碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)與應(yīng)用。

*通信作者：朱靖博（1963—），男（漢），教授，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)與應(yīng)用。

2011-12-10