肉制品中瘦肉精藥物殘留檢測方法的簡化研究

高亦軍，羅冠中

（天津市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測技術(shù)研究院，天津 300384）

肉制品中瘦肉精藥物殘留檢測方法的簡化研究

高亦軍，羅冠中

（天津市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測技術(shù)研究院，天津 300384）

研究、探討一種簡化樣品前處理過程的肉制品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇藥物殘留的檢測方法。與國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22286-2008《動物源性食品中多種β-受體激動劑殘留量的測定 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》相比，該方法選取添加高濃度（70%～72%）高氯酸對酶解樣品進(jìn)行直接提取和沉淀蛋白，而后通過固相萃取凈化，上機(jī)檢驗；省去了較為繁雜的調(diào)溶液pH，液液萃取等實驗步驟，提高了整個過程的檢驗效率。通過對該方法檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、精密度、檢出限的驗證和評價，結(jié)果均符合國家標(biāo)準(zhǔn)對檢驗方法的要求。該方法可以嘗試作為實驗室肉制品中3種β2-受體激動藥物殘留的篩查，甚至檢驗的參考方法。

肉制品；克倫特羅；萊克多巴胺；沙丁胺醇；前處理；簡化

克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇作為主要的β2-受體激動劑類藥物能夠調(diào)節(jié)動物機(jī)體物質(zhì)代謝，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成和加速脂肪分解，實現(xiàn)營養(yǎng)再分配，俗稱瘦肉精。瘦肉精雖然有助于動物生長和增加瘦肉率，但長期使用會使該藥蓄積在動物組織中，會對動物和人的肝臟、腎臟等器官產(chǎn)生相當(dāng)大的毒害作用，癥狀主要表現(xiàn)為頭痛、頭暈（54.2%）、四肢震顫（95.8%）、肌肉酸痛（75%）、多汗（47.9%）、胸悶（52.1%）和心悸（54.2%）等一系列癥狀[1]。我國已于1997年3月開始禁止生產(chǎn)和使用鹽酸克倫特羅[2]，隨后又明確禁止萊克多巴胺、沙丁胺醇等β2-興奮劑用于養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中，但是仍有不法分子違法兜售、使用鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺等“瘦肉精”藥物，使藥物殘留蓄積在動物體內(nèi)，傳遞到肉制品中，影響到食用者的健康和安全。

為此，我國農(nóng)業(yè)、衛(wèi)生、質(zhì)檢等多部門聯(lián)合對動物食品中瘦肉精含量展開廣泛、嚴(yán)厲的監(jiān)管和檢測，目前，肉制品中3種主要瘦肉精克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的檢測主要采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22286-2008《動物源性食品中多種β-受體激動劑殘留量的測定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》，該方法準(zhǔn)確，檢出限能達(dá)到0.5 μg/kg，不過其樣品前處理過程過于復(fù)雜，需要經(jīng)過酶解、多步的提取、萃取、調(diào)節(jié)pH、氮吹等步驟[3]，使得檢驗效率降低，增加了大樣品量肉制品的檢驗和風(fēng)險監(jiān)控的難度。本研究對肉制品中3種主要瘦肉精（克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇）藥物殘留檢驗的樣品前處理步驟進(jìn)行簡化，提高檢測效率，并且實驗結(jié)果達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)的要求水平。

1 材料與方法

1.1 材料

肉制品（醬豬頭肉、火腿、熏雞、醬牛肉）購于市場；標(biāo)準(zhǔn)樣品（鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇及其同位素內(nèi)標(biāo)）購于德國Dr.Ehrenstorfer公司；β-葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶（10000 units/mL，德國MERCK）。

0.2 mol/L乙酸銨或乙酸鈉緩沖液（配成濃度為0.2 mol/L乙酸銨或乙酸鈉，用適量乙酸調(diào)節(jié)pH至5.2）；甲醇、高氯酸（70%～72%）、乙酸鈉、氫氧化鈉、異丙醇、乙酸乙酯、甲酸、5%氨水甲醇溶液、乙腈（色譜純）、超純水；固相萃取柱（PCX，60 mg/3 mL）。

1.2 主要設(shè)備及儀器

液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國，Agilent，1200-6410B），全自動固相萃取儀（美國吉爾森GX-274 ASPEC）；恒溫?fù)u床，離心機(jī)，渦旋振蕩器，氮吹儀，超純水儀。

1.3 檢測方法

1.3.1 樣品提取

依照國標(biāo)法檢測的樣品前處理過程完全按照GB/T 22286-2008《動物源性食品中多種β-受體激動劑殘留量的測定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》。

簡化過程提取方法：稱取2 g（精確到0.01 g）經(jīng)勻漿的樣品于50 mL離心管中，加入8 mL 0.2 mol/L乙酸銨緩沖液，加入100 μL濃度均為10 ng/mL的3種混合同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入50 μL β-葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶，混勻后，37℃恒溫振蕩12 h。取出后，渦旋1 min，于離心管中加入80 μL高氯酸后渦旋振蕩，于4℃冷卻（脂肪含量較低的樣品可常溫）離心10 min（10000 r/min），濾紙過濾，濾液待凈化。

1.3.2 凈化

將PCX固相萃取柱放入自動固相萃取儀，依次用3 mL甲醇，3 mL水活化，將樣品濾液全部轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中，以0.5 mL/min流速過柱，用3 mL水，3 mL甲醇淋洗，抽干，最后用3 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫，洗脫液于40℃下氮?dú)獯蹈?，流動? mL溶解，待上機(jī)測試。

1.3.3 液相色譜—串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀檢測

a）色譜柱：ZORBAX SB-C18，2.1（內(nèi)徑）×100 mm，粒度 1.8 μm。

b）流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈。

梯度洗脫：0～1 min，4%B；1 min～1.01 min，4%～40%B；1.01 min～5 min，40%B；5 min～5.01 min，40%～90%B；停止時間9 min；平衡時間5 min。

c）流速：0.3 mL/min。

d）柱溫：30℃。

e）進(jìn)樣量：10 μL。

f）離子源：電噴霧（ESI），正離子模式。

g）掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。

h）干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：9 L/min；霧化氣壓：45 psi；毛細(xì)管電壓：4000 V。

i）監(jiān)測離子見表 1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）下的選擇離子及監(jiān)測條件Table 1 Selected ion and monitoring conditions in multi-reactions monitoring

1.3.4 定性、定量方法

采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時間和化合物的一個母離子和一對子離子進(jìn)行定性。

實驗結(jié)果采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，用3種藥物的同位素內(nèi)標(biāo)物法校正回收率。校正曲線方程見表2所示，其中 y為響應(yīng)值（resp.），x為濃度（ng/mL），標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)物的線性范圍均為0.5 ng/mL～20 ng/mL。

表2 3種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線及同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table 2 Standard curve equation(ESTD&ISTD)for three drugs

2 結(jié)果與討論

2.1 提取步驟簡化條件的確定

肉制品中的主要成分是蛋白質(zhì)和脂肪，在樣品提取和純化過程中，除去影響測定的主要干擾成分蛋白質(zhì)和脂肪至關(guān)重要。GB/T 22286-2008標(biāo)準(zhǔn)方法是在酶解后，采用先添加0.1 mol/L高氯酸溶液5 mL，再用高氯酸（70%～72%）調(diào)節(jié)pH到1左右來沉淀蛋白，而后用氫氧化鈉調(diào)pH至11，再用異丙醇-乙酸乙酯溶液提取，氮吹。此方法優(yōu)點(diǎn)是在提取的同時也對樣品進(jìn)行了一定程度的凈化，缺點(diǎn)是步驟繁多，降低檢測效率，而過多的實驗步驟容易造成結(jié)果重復(fù)性降低和偶然誤差。本方法在對樣品提取酶解后，試驗通過直接添加高濃度高氯酸（70%～72%），一方面可以沉淀蛋白，另外可以水解一部分脂肪，同時可以使測定的目標(biāo)化合物在酸性條件下離子化，增大溶出率和提取效率，并為下一步固相萃取凈化提供樣品液的酸性環(huán)境。對于脂肪含量較高的樣品冷卻離心可以將脂肪固化，過濾除去。相比于標(biāo)準(zhǔn)方法，本方法這一過程主要在提取殘留藥物的同時，除去主要干擾物蛋白質(zhì)和脂肪，至于一些糖類和小分子化合物，將主要利用固相萃取法進(jìn)行凈化。

本實驗對（70%～72%）高氯酸的添加量進(jìn)行了優(yōu)化，分別添加 20、40、60、80、100 μL，進(jìn)行結(jié)果比較，結(jié)果對于大部分樣品添加80、100 μL的樣品除蛋白效果最好，而且對3種目標(biāo)化合物檢測回收率相當(dāng)且最高，添加標(biāo)準(zhǔn)物濃度為10 μg/kg醬豬頭肉檢出3種藥物絕對回收率（未經(jīng)內(nèi)標(biāo)物校正）分別為克倫特羅83.5%，萊克多巴胺70.4%，沙丁胺醇75.2%，固選取添加80 μL高氯酸溶液。

2.2 簡化前處理方法對檢測結(jié)果準(zhǔn)確性、精密度的影響

在沒有獲得陽性樣品時，檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性通常用加標(biāo)回收率來評價[4]。本實驗選取4種未檢出目標(biāo)待測藥物的空白樣本醬豬頭肉、火腿、熏雞、醬牛肉作為樣品基質(zhì)，添加低、中、高3個標(biāo)準(zhǔn)水平濃度，每個濃度樣品用簡化法處理，經(jīng)6次測定取平均值，定性、定量方法按照1.3.4，測得結(jié)果計算回收率（表中回收率是經(jīng)同位素內(nèi)標(biāo)校正的檢測結(jié)果回收率）和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，分析結(jié)果如表3所示。

3種藥物的加標(biāo)回收率分別為克倫特羅90%～113%，萊克多巴胺86%～102%，沙丁胺醇93%～110%，均達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》檢驗方法確認(rèn)中關(guān)于回收率的要求[5]，而且經(jīng)內(nèi)標(biāo)物校正的回收率波動范圍與檢測結(jié)果的偏差相當(dāng)，這個波動基本上可認(rèn)為是檢測結(jié)果的偏差所致，可見經(jīng)同位素內(nèi)標(biāo)法定量校正的結(jié)果準(zhǔn)確度更高，基本消除了質(zhì)譜檢測常見的基質(zhì)效應(yīng)的影響[6]。3種藥物不同水平檢測結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為克倫特羅5.4%～13.8%，萊克多巴胺5.0%～14.5%，沙丁胺醇3.7%～14.0%。遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于GB/T 22286-2008提出的精密度要求：在重復(fù)性條件下獲得的2次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算數(shù)平均值的30%，同時也達(dá)到GB/T 27404-2008提出的對檢驗方法精密度的要求[5]。

表3 3種β2-受體激動劑類藥物的4種樣品基質(zhì)的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）Table 3 Recoveries and relative standard deviations(RSDs)for the 3 β2-agonists drug residues of 4 spiking sample matrixes %

2.3 方法檢出限

國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22286-2008中3種藥物殘留檢測方法的檢出限為0.5 μg/kg。研究簡化前處理方法對檢出限的影響，選取四種肉制品（醬豬頭肉、火腿、熏雞、醬牛肉）作為樣品基質(zhì)，通過在四種空白樣品中加入3種藥物的標(biāo)準(zhǔn)物、同位素內(nèi)標(biāo)物，使其在樣品中濃度均為0.5 μg/kg，進(jìn)行檢測結(jié)果評價，結(jié)果均能達(dá)到3倍信噪比的檢出限要求，圖1為加標(biāo)后的檢測譜圖（該樣品基質(zhì)為醬豬頭肉）。

圖1 加標(biāo)量為0.5 μg/kg樣品檢測結(jié)果的總離子流圖（樣品基質(zhì)為醬豬頭肉）Fig.1 Total ion current chromatography of sample matrix(salted head meat)with 0.5 μg/kg spiked

3 結(jié)論

肉制品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇在依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22286-2008《動物源性食品中多種β-受體激動劑殘留量的測定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》檢驗的基礎(chǔ)上，通過簡化和調(diào)整樣品前處理方法，省去了較為繁雜的實驗步驟，提高了整個過程的檢驗效率。同時，在檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、精密度、檢出限方面均能符合檢驗標(biāo)準(zhǔn)的要求，該方法可以嘗試作為實驗室大量肉制品中3種瘦肉精的篩查，甚至檢驗的參考方法。

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Research on Simplified Detection Method of Clenbuterol Residues in Meat Product

GAO Yi-jun,LUO Guan-zhong
（Tianjin Product Quality Inspection Technology Research Institute,Tianjin 300384,China）

A simplified sample preparation process is studied and discussed for the detection method of clenbuterol,ractopamine,salbutamol residues in meat product.Compared with the national standard GB/T 22286-2008,the method simplified more complex experimental steps and improved the efficiency of the whole inspection process.To achieve this purpose,the perchloric acid in high concentration（70%-72%）was added to the zymolytic sample to extract the target compounds and deposit protein,and then a further purification was carried out by solid phase extraction.The final result was tested on liquid chromatography with tandem quadrupole mass spectrometry.The accuracy,precision and detection limit of this simplified method was tested and verified accordingly with the national standard demand.And the method can be used as a screening and even determination method for the testing the laboratory to test the 3β2-agonists drug residues in meat product.

meat product;clenbuterol;ractopamine;salbutamol;sample preparation;simplify

高亦軍（1967—），女（漢），高級工程師，本科，從事食品安全分析、實驗室質(zhì)量管理研究。

2012-05-25