微波消解皂化HPLC法測(cè)定熏制食品中的PAHs

黃東萍，陸葉，黃明立，蔣貴發(fā)

（廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西 南寧 530021）

微波消解皂化HPLC法測(cè)定熏制食品中的PAHs

黃東萍，陸葉，黃明立，蔣貴發(fā)

（廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西 南寧 530021）

利用微波消解皂化熏肉、熏魚(yú)和熏腸3種熏制食品，并經(jīng)萃取、凈化、濃縮后用SUPELCOSIL LC-PAH色譜柱進(jìn)行分離，采用梯度洗脫方法，用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，從而建立微波消解皂化前處理法高效液相色譜檢測(cè)熏制食品中多環(huán)芳烴（PAHs）的方法。結(jié)果表明，微波消解在0.5 MPa壓力下加熱5 min可以取得較好的皂化效果，梯度洗脫能有效分離16種PAHs，各組分校正曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.9937～0.9995之間，加標(biāo)回收率為52.36%～118.39%，精密度變異系數(shù)為2.29%～10.13%。

微波消解皂化；高效液相色譜（HPLC）；多環(huán)芳烴；熏制食品

多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一組由2個(gè)或2個(gè)以上苯環(huán)稠和在一起的芳香族化合物及其衍生物，目前已知的有200多種。PAHs廣泛存在于環(huán)境中，煙熏肉制品中的多環(huán)芳烴主要是食品與燃料產(chǎn)物直接接觸、脂肪焦化與裂解、蛋白質(zhì)高溫分解與糖不完全燃燒等因素產(chǎn)生的[1]。PAHs具有較強(qiáng)致癌作用，它可通過(guò)皮膚、呼吸道及食品進(jìn)入人體，在芳烴羥化酶的作用下代謝活化為多環(huán)芳烴環(huán)氧化物，與DNA、RNA和蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合而誘發(fā)突變和腫瘤[2]。因此控制食品特別是熏、炸、腌、臘肉制品中的PAHs，減少其對(duì)人體的危害是很有必要的。目前肉制品中多環(huán)芳烴的前處理方法有索氏提取法、超聲波萃取、固相萃取和加速溶劑萃取[3]，而微波消解皂化熏肉制品的前處理方法鮮見(jiàn)報(bào)道。為了加快PHAs的檢測(cè)速度，更好地控制PHAs，本文對(duì)熏肉、熏魚(yú)和熏腸3種熏制食品的樣品前處理和PAHs檢測(cè)方法進(jìn)行了摸索。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-10ATVP高效液相色譜儀：日本島津公司；光纖壓力自控密閉微波消解系統(tǒng)：上海新科微波溶樣測(cè)試技術(shù)研究所；GSY-11電熱恒溫水浴鍋：北京市醫(yī)療設(shè)備廠；BS11OS電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；0.45 μm 濾膜。

1.2 材料與試劑

市購(gòu)熏肉、熏魚(yú)、熏腸；

乙腈：色譜純，美國(guó)TEDIA公司；超純水：法國(guó)MILLIPORE超純水器制造；甲醇、石油醚、濃硫酸、氫氧化鉀、氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉均為國(guó)產(chǎn)分析純。

EPA61016種多環(huán)芳烴混標(biāo)：100μg/mL～2000μg/mL，美國(guó)SUPELCO公司，甲醇-二氯乙烷1:1。

16 種 PAHs組分及含量如下：苊（1000 μg/mL）、苊烯（2000μg/mL）、蒽（100μg/mL）、苯并（a）蒽（100μg/mL）、苯并（a）芘（100 μg/mL）、苯并（b）熒蒽（200 μg/mL）、苯并（g，h，i）芘（200 μg/mL）、苯并（k）熒蒽（100 μg/mL）、屈（100 μg/mL）、茚并（a，h）蒽（200 μg/mL）、熒蒽（200 μg/mL）、芴（200 μg/mL）、茚 并（1，2，3－cd）芘（100 μg/mL）、萘（1000 μg/mL）、菲（100 μg/mL）、芘（100 μg/mL）。

2 方法

2.1 色譜條件

SUPELCOSIL LC-PAH 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：純乙腈，流動(dòng)相B：超純水；梯度洗脫程序：0 min～5 min，A 保持 40%；5 min～30 min，A 由40%線性增加至100%；30 min～40 min，A維持100%；流速：1.5 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣：10 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

PAHs混合儲(chǔ)備液的制備：精密吸取0.5 mL PAHs混標(biāo)（100 μg/mL～2000 μg/mL）至10 mL 棕色容量瓶中，乙腈定容即得PAHs混合儲(chǔ)備液（5μg/mL～100μg/mL）。

PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的制備：精密吸取PAHs混合儲(chǔ)備液5.0 mL于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混勻，制成PAHs標(biāo)準(zhǔn)使用液（2.5 μg/mL～50 μg/mL）；從PAHs標(biāo)準(zhǔn)使用液中精密吸取 0.10、0.20、0.40、0.80、1.20、1.60 mL 至 6 個(gè) 10 mL 棕色容量瓶中，分別用乙腈定容即得PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（0.025 μg/mL～0.5 μg/mL、0.05 μg/mL～1 μg/mL、0.1 μg/mL～2 μg/mL、0.2 μg/mL～4 μg/mL、0.3 μg/mL～6 μg/mL、0.4 μg/mL～8 μg/mL）。

2.3 樣品前處理及測(cè)定

稱取一定量樣品，用食品攪拌機(jī)攪碎、混勻；分別準(zhǔn)確稱取樣品1g3份，置于3個(gè)溶樣杯中，加入10.0mL KOH甲醇溶液（1 mol/L），蓋好活塞，置于試樣罐中，在微波消解系統(tǒng)中以0.5 MPa壓力加熱5 min進(jìn)行皂化，自然冷卻至常溫。將皂化液過(guò)濾后合并移入125 mL分液漏斗中，用10 mL蒸餾水分兩次洗溶樣杯，合并洗液于分液漏斗中，分別用20mL石油醚提取皂化液3次，合并提取液。向萃取液中緩慢滴加6 mL濃硫酸，輕輕振蕩后靜置分層，棄去磺化層，用30 mL 50 g/L氯化鈉溶液洗2次，最后加入8 g無(wú)水硫酸鈉脫水、過(guò)濾，置于恒溫水浴鍋內(nèi)蒸干，用少量甲醇溶解殘?jiān)筠D(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容得樣品提取濃縮液。樣品提取濃縮液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，取10 μL注入高效液相色譜儀測(cè)定，根據(jù)校正曲線計(jì)算各組分含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 皂化方法的選擇

在摸索微波消解皂化條件時(shí)，選擇了在0.5、1 MPa壓力下各皂化3、5、7 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 min時(shí)皂化不完全，1 MPa壓力及7 min條件下出現(xiàn)了溶劑泄漏，因此本試驗(yàn)采用0.5 MPa與5 min作為的皂化壓力與皂化時(shí)間。與其他前處理方法相比，微波消解皂化徹底且耗時(shí)很短，適合于含大量脂肪的肉類食品中多環(huán)芳烴的快速測(cè)定。

3.2 校正曲線與方法檢出限

在選定的試驗(yàn)條件下，16種PAHs分離效果良好，如圖1所示。

圖1 PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜Fig.1 Chromatograph mix standard PAHs

以峰面積為橫坐標(biāo)，各組分濃度為縱坐標(biāo)得到相應(yīng)的校正曲線結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，所有校正曲線方程的相關(guān)系數(shù)均在0.9937～0.9995之間，表明其具有良好的線性關(guān)系，以信噪比為3計(jì)算各PAH的檢出限結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 校正曲線及方法的檢出限Table 1 Correction curve and detection limit

續(xù)表1 校正曲線及方法的檢出限Continue table 1 Correction curve and detection limit

3.3 方法回收率與精密度

將已知含量的熏肉分為2組，準(zhǔn)確稱取后，分別加入 0.05 μg/mL～1 μg/mL 和 0.2 μg/mL～4 μg/mL 的 PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.0 mL作為高低濃度組，按樣品前處理和測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，每組做6個(gè)平行樣。加標(biāo)回收測(cè)定結(jié)果及精密度見(jiàn)表2。

表2 PAHs加標(biāo)回收率與精密度（n=6）Table 2 PAHs recovery and precision test(n=6)

結(jié)果顯示低濃度組PAHs的加標(biāo)回收率在65.35%～101.09%之間，平均回收率為87.32%，RSD在4.36%～8.35%之間，平均RSD為6.49%；高濃度組PAHs的加標(biāo)回收率在66.31%～96.29%之間，平均回收率為87.71%，RSD在3.78%～8.66%之間，平均RSD為6.61%。表明方法回收率與精密度均良好。

3.4 樣品的測(cè)定結(jié)果

3類熏制食品中均檢測(cè)出PAHs，其中熏肉中檢出13種，熏魚(yú)中檢出12種，熏腸中檢出13種。各樣品PAHs的含量見(jiàn)表3。

表3 樣品中多環(huán)芳烴含量Table 3 Contents of PAHs in sample μg/kg

續(xù)表3 樣品中多環(huán)芳烴含量Continue table 3 Contents of PAHs in sample μg/kg

3類樣品中均不同程度地含有致癌物[4]，特強(qiáng)致癌物苯并（a）芘和茚并（a，h）蒽、強(qiáng)致癌物苯并（b）熒蒽和苯并（k）熒蒽在3類熏制食品中均被檢出且在部分樣品中含量比較高；致癌物苯并（a）蒽和弱致癌物屈在3類熏制食品中均被檢出。熏腸樣品圖譜，見(jiàn)圖2。

圖2 熏腸樣品圖譜Fig.2 Chromatograph of smoked sausage

4 結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示：使用微波消解在0.5 MPa壓力下加熱5 min可以取得較好的皂化效果；高效液相色譜分離過(guò)程中使用梯度洗脫能有效分離16種PAHs，各組分校正曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.9937～0.9995之間，加標(biāo)回收率為52.36%～118.39%，精密度變異系數(shù)為2.29%～10.13%。說(shuō)明本文使用微波消解的皂化方法處理樣品簡(jiǎn)便快捷，凈化效果好，與高效液相色譜法方法聯(lián)用能同時(shí)測(cè)定16種PAHs，回收率和精密度均符合要求，適合熏制食品中PAHs的含量測(cè)定。

在本次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)部分樣品除苯并（a）芘含量較高外，其他致癌性PAHs含量也較高。2008年歐洲食品安全局提出食品中的PAHs不應(yīng)單獨(dú)以苯并（a）芘作為控制指標(biāo)，而應(yīng)以PHA2、PHA4或PHA8來(lái)衡量PHAs的基因毒性和致癌性會(huì)更加有效[5-6]。PHA2是指苯并（a）芘和屈2種PAHs含量總和，PHA4是指苯并（a）芘、屈、苯并（a）蒽和苯并（b）熒蒽 4種 PAHs含量總和，PHA8是指苯并（a）芘、屈、苯并（a）蒽、苯并（b）熒蒽、苯并（k）熒蒽、苯并（g，h，i）芘、茚并（a，h）蒽和茚并（1，2，3－cd）芘 8種 PAHs含量總和。筆者比較贊成以PHA8作為PHAs的控制指標(biāo)，也建議相關(guān)部門提高食品中PHAs的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，以更好地保障人們的食品安全。

[1]崔國(guó)梅,彭增起,孟曉霞.煙熏肉制品中多環(huán)芳烴的來(lái)源及控制方法[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2010,31(3):180-183

[2]孫長(zhǎng)顥.營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2007:312-313

[3]萬(wàn)紅麗,周光宏,徐幸蓮,等.肉制品中多環(huán)芳烴前處理技術(shù)的研究進(jìn)展[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2006,27(8):124-126

[4]岳敏,谷學(xué)新,鄒洪,等.多環(huán)芳烴的危害與防治[J].首都師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2003,24(3):40-44

[5]European Commission.Regulation(EC)No 208/2005 of 4 February 2005 amending Regulation(EC)No 466/2001 as regards polycyclic aromatic hydrocarbons[Z].Official journal of the european community,2005,L 34:3-5

[6]EFSA.Scientific opinion of the panel on contaminants in the food chain on a request from the European Commission on Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Food[Z].The EFSA Journal,2008:724

Determination of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Smoked Foods by Microwave Digestion Saponification and HPLC

HUANG Dong-ping,LU Ye,HUANG Ming-li,JIANG Gui-fa
(Public Health School of Guangxi Medical University,Nanning 530021,Guangxi,China)

Three kinds of sample such as smoked meat,fish and sausage,were saponified by microwave digestion.Polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs)in them were extracted,purified,condensed and separated by SUPELCOSIL LC-PAH column.Thus the method for determination of PAHs in smoked foods by microwavedigestion-saponification pre-treatment and HPLC was established.The result showed microwave digestion which was carry out with 0.5 MPa for 5 min could obtain better extraction efficiencies.The component of 16 PHAs were divided completely by the column in combination of a gradient elution.The linear relation of correction curve for all components was good.The correlation coefficient of PAHs ranged from 0.9937 to 0.9995.The recoveries were between 52.36%-118.39%.The RSD of precision varied between 2.29%-10.13%.

microwave digestion saponification;HPLC;PAHs;smoked foods

廣西青年科學(xué)基金（桂科青0832048）

黃東萍（1971—），女（漢），副教授，碩士研究生，研究方向：色譜分析。

2011-12-23