豬軟骨Ⅱ型膠原蛋白的制備及結(jié)構(gòu)表征

劉高梅，任海偉 ，王永剛

（1.山西輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院輕工化工工程系，山西 太原 030013；2.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050）

豬軟骨Ⅱ型膠原蛋白的制備及結(jié)構(gòu)表征

劉高梅1，任海偉2，*，王永剛2

（1.山西輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院輕工化工工程系，山西 太原 030013；2.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050）

從豬軟骨中提取純化Ⅱ型膠原蛋白，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。結(jié)果表明，豬軟骨Ⅱ型膠原蛋白的最佳提取條件為溫度35℃、加酶量0.8%胃蛋白酶、時(shí)間25 h，該條件下膠原蛋白提取率可達(dá)49.28%，純度為92.65%。SDS-PAGE結(jié)果顯示Ⅱ型膠原蛋白有2條α鏈和1條β鏈。紅外光譜和電鏡掃描結(jié)果顯示該膠原蛋白具有典型的酰胺基團(tuán)，有完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)。

豬軟骨；Ⅱ型膠原蛋白；提??；結(jié)構(gòu)表征

膠原蛋白是一種天然高分子化合物，是結(jié)締組織重要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，廣泛存在于動(dòng)物的皮、骨、軟骨、牙齒、肌腱、韌和血管中[1]。膠原蛋白分子由3條α多肽鏈緊緊環(huán)繞形成三螺旋結(jié)構(gòu)，每條α多肽鏈由重復(fù)的三聯(lián)體序列（Gly－X－Y）n組成，X和Y一般是脯氨酸（Pro）和羥脯氨酸（HyP）。目前已報(bào)道的膠原蛋白類(lèi)型共有19種，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、和Ⅴ型是纖維狀的膠原蛋白。膠原蛋白具有一定的凝膠強(qiáng)度、乳化能力和低黏度等功能性質(zhì)以及生物相容性、低免疫原性、可降解性、止血與促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、吸水保濕等醫(yī)學(xué)特性[2]。Ⅱ型膠原蛋白是軟骨基質(zhì)中含量最高的主要有機(jī)成分，為軟骨組織的特征性蛋白，與糖胺多糖形成緊密的結(jié)合，使軟骨具有柔韌性，能吸收沖擊和承受負(fù)載。Ⅱ型膠原蛋白特有的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成不僅使其在生物醫(yī)學(xué)材料、藥物輸送載體、組織工程、化妝品及食品等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[3]，而且對(duì)于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎和骨腫瘤等疾病方面也起著重要的作用[4-6]。

軟骨是畜禽加工的副產(chǎn)物，主要應(yīng)用于食品與飼料工業(yè)中。研究表明，豬Ⅱ型膠原蛋白與人關(guān)節(jié)內(nèi)的Ⅱ型膠原蛋白同源性較高。因此，為了擴(kuò)展Ⅱ型膠原蛋白來(lái)源途徑，并有效利用豬軟骨資源，本文以豬軟骨為原料，采用酸酶結(jié)合法提?、蛐湍z原蛋白，并研究其結(jié)構(gòu)特性，以期為豬軟骨膠原蛋白在生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬軟骨，市售，生理鹽水清洗后切成薄片狀（0.5 cm×0.5 cm），烘干粉碎后得到豬軟骨粉，備用。豬軟骨粉成分為：水分7.17%，灰分9.31%，蛋白質(zhì)53.38%，脂肪1.47%，碳水化合物28.67%。

Ⅱ型膠原蛋白（純度＞98%）：sigma公司；羥脯氨酸（純度＞98%）：上海索萊寶生物科技有限公司；胃蛋白酶：鄭州荔諾生物科技有限公司；氯胺T、N，N－甲叉雙丙烯酰胺：上海艾研生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)R250：上海佳和生物科技有限公司；單體丙烯酰胺、對(duì)二甲氨基苯甲醛、正丙醇、異丙醇等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CARY 50紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：美國(guó)VARIAN公司；HPX-9162MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；FD-1-55真空冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UNIVERSAL32R冷凍高速離心機(jī)：German公司；DYY-12電泳儀：北京市六一儀器廠；Nexus670 FT-IR傅里葉變換紅外光譜儀：美國(guó)尼高力公司。

1.3 方法

1.3.1 豬軟骨原料的成分分析

水分含量測(cè)定參照GB 5009.3-2010《食品中水分的測(cè)定》；脂肪含量測(cè)定參照GB/T 14772-2008《食品中粗脂肪的測(cè)定》；蛋白質(zhì)含量測(cè)定參照GB 5009.5-2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》，灰分含量測(cè)定參照GB 5009.4-2010《食品中灰分的測(cè)定》，碳水化合物含量測(cè)定采用蒽酮比色法。

1.3.2 豬軟骨膠原蛋白的提取純化工藝流程

軟骨粉→乙醚脫脂（4℃，48h）→脫除鹽溶性雜蛋白（1 mol/LNaCl）→脫鈣（0.1 mol/L EDTA，48 h）→去除蛋白多糖（4mol/L鹽酸胍，4℃，24h）→離心（12000r/min，20 min）→沉淀→含有胃蛋白酶的乙酸溶液（乙酸濃度0.5 mol/L）→離心（條件同上）→上清液→鹽析（3 mol/L NaCl，4 ℃，36 h）→透析（4 ℃，48 h）→DEAE-52 離子交換樹(shù)脂洗脫（0.2 mol/L NaCl-Tris-HCl）→分步收集→真空冷凍干燥→膠原蛋白純品[7]。

1.3.3 膠原蛋白含量的測(cè)定

膠原蛋白含量以羥脯氨酸含量計(jì)，參照GB/T 9695.23-2008/ISO3496：1994《肉與肉制品羥脯氨酸含量測(cè)定》中方法測(cè)定。首先建立羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合回歸方程為C=0.21734A－0.00005（R2=0.9987），式中：C 為羥脯氨酸濃度，（mg/L）；A為吸光度值。然后對(duì)本試驗(yàn)提取的膠原蛋白按標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法測(cè)定其吸光度，按回歸方程換算出樣品中的羥脯氨酸濃度。計(jì)算膠原蛋白提取率和純度[1]。膠原蛋白提取率計(jì)算公式為：

1.3.4 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)（SDS-PAGE）

[8]和[9]進(jìn)行。

1.3.5 傅里葉變換紅外光譜分析

參考文獻(xiàn)[10]。

1.3.6 電鏡掃描

委托中科院蘭州化學(xué)物理研究所檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠原蛋白提取工藝研究

2.1.1 加酶量對(duì)膠原蛋白提取率的影響

加酶量對(duì)膠原蛋白提取率的影響，見(jiàn)圖1。

圖1 加酶量對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of enzyme addition amount on extraction rate of collagen

由圖1可知，在加酶量為0.2%～0.8%范圍內(nèi)，隨著加酶量的增加，膠原蛋白提取率逐漸提高，當(dāng)加酶量大于0.8%時(shí)提取率趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)?，如果加酶量過(guò)低，則與底物不能充分反應(yīng)，而加酶量過(guò)高則會(huì)引起酶分子之間的相互作用，阻止酶解反應(yīng)的順利進(jìn)行。因此，最適加酶量確定為0.8%。

2.1.2 時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響

時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響，見(jiàn)圖2。

圖2 時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of time on extraction rate of collagen

由圖2可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，膠原蛋白提取率逐漸增加，但時(shí)間25 h后提取率減緩，甚至有下降趨勢(shì)，說(shuō)明時(shí)間的適當(dāng)延長(zhǎng)有利于膠原蛋白提取率的最大化。這是因?yàn)?，天然膠原是不可溶的，必須使用胃蛋白酶切除三股螺旋鏈兩端的端肽才能轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄阅z原蛋白。當(dāng)提取時(shí)間較短時(shí)，胃蛋白酶作用有限，Ⅱ型膠原還不能完全溶解到溶液中，而當(dāng)Ⅱ型膠原蛋白的提取率達(dá)到某一極限值時(shí)，即使延長(zhǎng)提取時(shí)間提取率也不會(huì)有明顯的增加，反而使無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)增加。因此，提取時(shí)間確定為25 h。

2.1.3 溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響

膠原蛋白的變性溫度在pH中性時(shí)為40℃～41℃，酸性時(shí)為38℃～39℃，因此膠原蛋白最好在低溫環(huán)境進(jìn)行提取。溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響，見(jiàn)圖3。

圖3 溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of temperature on extraction rate of collagen

由圖3可知，隨著溫度的升高，膠原蛋白提取率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，溫度30℃時(shí)提取率最高為49.27%。這是因?yàn)?，一方面，在酶促反?yīng)中，溫度的升高有利于使更多酶的能量達(dá)到反應(yīng)的活化能，從而加快酶解反應(yīng)的速度并提高提取率；另一方面，溫度超過(guò)胃蛋白酶的最適溫度后，酶活力反而下降甚至酶失活。另外，溫度過(guò)高還會(huì)裂解膠原蛋白的氫鍵和共價(jià)鍵，導(dǎo)致其分子結(jié)構(gòu)遭到破壞而變性，影響其生理活性。溫度35℃～40℃時(shí)提取率最低，說(shuō)明該溫度范圍已接近Ⅱ型膠原的變性溫度，可能有部分Ⅱ型膠原已經(jīng)發(fā)生變性。綜合考慮確定提取溫度為30℃。

2.2 結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 傅里葉變換紅外光譜

FT-IR可以表征膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)，豬軟骨膠原蛋白紅外圖譜，見(jiàn)圖4。可知，3330 cm-1處吸收峰為酰胺A帶N-H伸縮振動(dòng)，而且N-H伸縮與氫鍵形成了締合體；3095 cm-1吸收峰是酰胺B帶C-H伸縮振動(dòng)，1656 cm-1處出現(xiàn)酰胺I帶的C=O伸縮強(qiáng)振動(dòng)峰，也是形成三股螺旋內(nèi)氫鍵的C=O基團(tuán)的振動(dòng)峰；1558 cm-1處是酰胺Ⅱ帶的N-H彎曲振動(dòng)吸收蜂；1456cm-1處屬于膠原蛋白氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)，應(yīng)是苯環(huán)骨架振動(dòng)造成的，說(shuō)明有苯環(huán)存在。1240 cm-1為酰胺Ⅲ帶的N-H伸縮振動(dòng)變形峰。圖譜中相應(yīng)的波數(shù)符合膠原的吸收峰位，可以證明本實(shí)驗(yàn)所提取的樣品為具有完整三股螺旋的膠原蛋白[11]。

圖4 豬軟骨膠原蛋白紅外圖譜Fig.4 FT-IR spectrum of collagen from porcine articular cartilage

2.2.2 SDS-PAGE電泳

SDS-PAGE電泳，見(jiàn)圖5。

圖5 SDS-PAGE電泳圖譜Fig.5 SDS-PAGE electrophoretic spectrum of collagen

由圖5可知，膠原蛋白含2條α鏈（α1和α2）和聚合鏈β，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所提取的豬軟骨膠原蛋白是Ⅱ型膠原蛋白，其中α1鏈的相對(duì)分子量約為120 ku，α2鏈相對(duì)分子量約為111 ku，β鏈相對(duì)分子量約為200 ku。

2.2.3 電鏡掃描

軟骨膠原蛋白電鏡掃描圖，見(jiàn)圖6。

圖6 軟骨膠原蛋白電鏡掃描圖Fig.6 Scanning electron microscope of collagen

由圖6電鏡掃描結(jié)果可知，豬軟骨Ⅱ型膠原蛋白由膠原纖維形成，且膠原纖維排列致密，直徑很細(xì)，并相互交織成網(wǎng)狀，具有三螺旋結(jié)構(gòu)的成纖膠原蛋白特征。

3 結(jié)論

采用酸酶結(jié)合法提取豬軟骨Ⅱ型膠原蛋白，最佳提取條件為溫度35℃、胃蛋白酶的加酶量0.8%、提取時(shí)間25 h，該條件下膠原蛋白提取率可達(dá)49.28%，純度為92.65%。SDS-PAGE結(jié)果顯示Ⅱ型膠原蛋白有2條α鏈和1條β鏈。紅外光譜和電鏡掃描結(jié)果顯示該Ⅱ型膠原蛋白具有典型的酰胺基團(tuán)，有完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)。這說(shuō)明提取過(guò)程中，胃蛋白酶對(duì)豬軟骨Ⅱ型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)沒(méi)有破壞，可使膠原二級(jí)結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定，該提取工藝可行。

參考文獻(xiàn)：

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Preparation Technology and Structure Characterization of Collagen TypeⅡfrom Porcine Cartilage

LIU Gao-mei1,REN Hai-wei2,*,WANG Yong-gang2
（1.School of Light Industrial Chemical Engineering,Shanxi Light Industry Technical College,Taiyuan 030013,Shanxi,China;2.College of Life Science and Engineering,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,Gansu,China）

Collagen typeⅡ was isolated from porcine cartilage and characterized.In the present study,the effects of enzyme addition amount,temperature,and time on extraction rate of collagen typeⅡwere explored.The results showed that the optimal conditions for collagen typeⅡextraction were pepsin dose 0.8%(calculated based on crude protein weight),temperature of 35℃,and time of 25 h.Under these conditions,the extraction efficiency of collagen was 49.28%,the purity reached 92.65%.It was revealed that three protein chains(i.e.two α chains and one β chain)existed in collagen type II by SDS-PAGE electrophoresis.Furthermore,a complete triple helix structure was also noticed by FT-IR and electron microscope scanning.

porcine cartilage;collagen type II;extraction;structure characterization

劉高梅（1969—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品科學(xué)。

*通信作者

2012-06-25