仙人掌及其多糖對(duì)幾種食品污染菌的抑菌作用

袁海娜

（1.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310023；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310023）

仙人掌及其多糖對(duì)幾種食品污染菌的抑菌作用

袁海娜1，2

（1.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310023；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310023）

采用水提醇沉法制備仙人掌多糖（簡(jiǎn)稱OPS），并分析三氯乙酸脫雜蛋白的方法對(duì)多糖抑菌作用的干擾；采用管碟法和混合涂布法研究OPS及仙人掌粉對(duì)食品中E.coli（大腸肝菌）、S.aureus（金黃色葡萄球菌）、S.cerevisiae（釀酒酵母）和P.frequentans（青霉）等常見污染菌的抑菌效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三氯乙酸會(huì)造成OPS的假陽性抑菌反應(yīng)，利用乙二醇可以將OPS中的三氯乙酸去除；與E.coli和P.frequentans相比較，OPS及仙人掌粉對(duì)S.aureus和S.cerevisiae的抑菌效果明顯；混合涂布法較管碟法更適宜檢測(cè)OPS等水溶液具有一定黏稠度的抑菌劑的抑菌效果。

仙人掌多糖；抑菌方法；抑菌作用

仙人掌（Opuntia）是傳統(tǒng)的中藥材，其主要化學(xué)成分及藥理功效得到了廣泛的關(guān)注[1]。其中仙人掌多糖（Opuntia Polysaccharide，簡(jiǎn)稱OPS）是其重要的功效成分之一[2]。作為重要的植物多糖，OPS具有抗衰老、抗癌、消炎、降血糖、降血脂、減肥及美容等功效，在醫(yī)藥及保健食品方面都具有廣泛的開發(fā)與應(yīng)用價(jià)值[3-6]。

翁佩芳、李冬生[7-8]等研究發(fā)現(xiàn)：仙人掌提取物對(duì)一些常見食品污染菌有抑制與殺滅作用；5%的仙人掌提取物抑菌作用優(yōu)于食品防腐劑苯甲酸鈉。同時(shí)，仙人掌提取物急性毒性試驗(yàn)表明[9]：仙人掌食用安全，無毒副作用。為了進(jìn)一步探究仙人掌及其OPS提取物的抑菌功效和作為天然防腐劑的開發(fā)前景，本實(shí)驗(yàn)選取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、釀酒酵母和青霉為供試菌，研究了仙人掌及其OPS的抑菌活性，為OPS的應(yīng)用開發(fā)及仙人掌的深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

仙人掌干粉：購于杭州蕭山云祥食品有限公司。試驗(yàn)菌種：大腸桿菌（E.coli），金黃色葡萄球菌（S.aureus），釀 酒 酵 母 （S.cerevisiae） 和 青 霉（P.frequentans）均由浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試劑

丙酮、乙醇、三氯乙酸、氯仿、正丁醇等均為分析純?cè)噭?/p>

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于培養(yǎng)細(xì)菌；PDA（馬鈴薯）培養(yǎng)基用于培養(yǎng)霉菌；豆芽汁蔗糖培養(yǎng)基用于培養(yǎng)酵母。

1.3 主要儀器設(shè)備

HITACHI CF15R高速冷凍離心機(jī)：日本日立有限公司；RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞東生化儀器廠；ZDX-35B不銹鋼座式消毒器：上海申安醫(yī)療器械廠；250A生化培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；MJ-250B-Z霉菌培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)公司；SCW-HS超凈工作臺(tái)：蘇州紅瑞凈化科技有限公司；Labconco freezone凍干機(jī)：美國Labconco公司。

1.4 方法

1.4.1 OPS的制備

OPS的制備，見圖1。

圖1 OPS制備工藝Fig.1 Preparation technology of opuntia polysaccharide

1.4.2 OPS蛋白質(zhì)的去除

本試驗(yàn)采用常用的Savag法和三氯乙酸（TCA）法[10]去除OPS中的雜蛋白。

1.4.3 OPS抑菌試驗(yàn)方法

1.4.3.1 管碟法（牛津杯直徑為8 mm）

在超凈工作臺(tái)中取2個(gè)培養(yǎng)基平板，分別加1 mL經(jīng)適當(dāng)稀釋的菌懸液，用無菌涂布棒均勻涂布，制成含菌平板。待平板表面稍干后，用無菌鑷子將已滅菌的牛津杯插在培養(yǎng)基上，每個(gè)平皿插4個(gè)，分別向其中加入400 μL無菌水，10%OPS溶液，10%仙人掌干粉溶液和20%乙醇溶液，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌體或菌落的生長情況。

1.4.3.2 混合涂布法[11]

取3個(gè)固體瓊脂培養(yǎng)基平板，在超凈工作臺(tái)中取4支5 mL的小試管，分別加入1 mL無菌水，1 mL10%OPS溶液，1 mL 10%仙人掌干粉溶液，1 mL 20%乙醇溶液。再在上述4支試管中分別加入1mL菌懸液，混勻。將4支試管中的液體分別傾倒入4個(gè)固體瓊脂培養(yǎng)基平板中，用無菌涂布棒涂布均勻，倒置培養(yǎng)，觀察菌體或菌落的生長情況。本實(shí)驗(yàn)將此方法定義為“混合涂布法”。

2 結(jié)果與分析

2.1 OPS制備過程中脫蛋白方法對(duì)其抑菌作用的影響

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，采用TCA法去除OPS中所含雜蛋白，會(huì)使得三氯乙酸與極性多糖結(jié)合，導(dǎo)致多糖溶液呈現(xiàn)強(qiáng)酸性，從而造成多糖抑菌試驗(yàn)中的顯著的假陽性反應(yīng)。因此為了確保抑菌試驗(yàn)結(jié)果的有效性與準(zhǔn)確性，需將粗多糖中的三氯乙酸徹底去除。

本實(shí)驗(yàn)分別采用乙二醇和透析2個(gè)方法除去OPS中殘留的三氯乙酸。方法如下：（1）乙二醇法：向OPS水溶液中加入乙二醇溶劑，混勻。再加入95%乙醇沉淀多糖，并收集沉淀。將上述操作反復(fù)多次，可以徹底去除三氯乙酸，使OPS水溶液呈中性。分析其原因可能是由于乙二醇的強(qiáng)極性性質(zhì)，根據(jù)相似相容理論，三氯乙酸易溶解于乙二醇溶液中，從而在多糖的反復(fù)溶解-沉淀過程中被除去；（2）透析法：將OPS溶液裝入透析袋中，并放入裝有蒸餾水的燒杯中透析過夜，中間更換2次蒸餾水。結(jié)果發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)所得OPS水溶液呈現(xiàn)中性。

經(jīng)除蛋白后，以硫酸-苯酚比色法[12]測(cè)定得仙人掌粉中OPS得率為12.56%。

2.2 管碟法中仙人掌及其OPS的抑菌活性

實(shí)驗(yàn)中采用管碟法所得仙人掌及其OPS的抑菌效果及抑菌圈見圖2和表1。

圖2 OPS及仙人掌粉在管碟法中的抑菌效果Fig.2 Antibacterial activity of OPS and opuntia powder by means of tube disc method

表1 管碟法中OPS及仙人掌粉抑菌效果（以抑菌圈直徑計(jì)）Table 1 Antimicrobial zone diameters of OPS and opuntia powder by means of tube disc method mm

由圖2和表1可以看出，OPS和仙人掌粉浸提液對(duì) S.aureus、S.cerevisiae、P.frequentans有抑菌作用，尤其對(duì)S.aureus和S.cerevisiae抑菌作用較強(qiáng)，但對(duì)E.coli無抑菌效果。

2.3 混合涂布法中仙人掌及其OPS的抑菌活性

OPS及仙人掌粉在混合涂布法中的抑菌效果及混合涂布法中OPS及仙人掌粉抑菌效果，見圖3和表2。

圖3 OPS及仙人掌粉在混合涂布法中的抑菌效果Fig.3 Antibacterial activity of OPS and opuntia powder by means of mixture spread plate method

表2 混合涂布法中OPS及仙人掌粉抑菌效果（以cfu/cm2計(jì)）Table 2 Colony forming units of OPS and opuntia powder by means of mixture spread plate method

從圖3和表2中可以看出，OPS和仙人掌粉浸提液能夠顯著抑制S.aureus和S.cerevisiae菌的生長和繁殖。而在15 h～18 h的恒溫培養(yǎng)期內(nèi)，E.coli和P.frequentans均出現(xiàn)成片菌落，菌落數(shù)不可計(jì)。同時(shí)，從圖3中平皿菌落的密集度分析表明：OPS與仙人掌粉浸提液對(duì)E.coli抑菌效果不明顯，而對(duì)P.frequentans有一定的抑菌效果。

在管碟法和混合涂布法抑菌試驗(yàn)中，仙人掌及其OPS均未檢測(cè)到對(duì)E.coli的抑菌活性，此結(jié)果與郭慶啟[13]等的研究結(jié)果不同。多糖的抑菌機(jī)理說法不一，但從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，仙人掌及其OPS對(duì)G+和G-菌抑菌效果不同，是否與OPS分子量、G+與G-菌不同的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)等有關(guān)，還待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

1.仙人掌及其OPS對(duì)食品中常見污染菌的作用有如下特點(diǎn)：

1）OPS和仙人掌粉浸提液對(duì)細(xì)菌中的S.aureus等G+有較明顯的抑菌作用，但對(duì)E.coli等G-無明顯陽性反應(yīng)。與霉菌相比，對(duì)酵母抑菌效果較好。但其抑菌機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

2）OPS抑菌活性優(yōu)于仙人掌粉浸提液，這可能與兩者的水溶性和黏稠度有關(guān)。OPS在水中的溶解度大于仙人掌粉，而且OPS水溶液的黏稠度小于仙人掌浸提液，使其更利于在瓊脂平板培養(yǎng)基中的擴(kuò)散，從而提高了抑菌作用。

3）OPS與仙人掌粉浸提液對(duì)供試菌種抑菌譜基本一致，抑菌效果也相當(dāng)，說明OPS為仙人掌粉浸提液中的主要抑菌成分。

2.本實(shí)驗(yàn)選擇濾紙片法檢測(cè)仙人掌浸提液及其OPS的抑菌效果時(shí)，所選菌種均未出現(xiàn)抑菌陽性反應(yīng)。而管碟法和混合涂布法均取得了較好的抑菌效果。分析原因可能是由于仙人掌浸提液及其OPS溶解液均有一定黏稠度，從而影響了其在濾紙片和瓊脂平板培養(yǎng)基中的擴(kuò)散和滲透速率，無法發(fā)揮抑菌作用。因此，根據(jù)抑菌劑的物化性質(zhì)，選擇合適的試驗(yàn)方法，對(duì)于抑菌試驗(yàn)效果的檢測(cè)非常重要。

本實(shí)驗(yàn)中還比較研究了管碟法和混合涂布法。二者在所選抑菌劑的試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)了抑菌陽性反應(yīng)。但后者操作簡(jiǎn)便，菌液與抑菌劑充分混合，受黏稠度影響比較小。同時(shí)，混合涂布法更接近于大部分食品中防腐劑與所污染菌的相互作用方式，值得推廣。

3.在后續(xù)的研究工作中，著重以下2個(gè)方面：

1）實(shí)驗(yàn)將OPS與乳酸鏈球菌素（Nisin）、聚賴氨酸（Polylysine）以及那它霉素（Natamycin）等生物防腐劑進(jìn)行復(fù)合，開發(fā)適用于各類食品的生物防腐劑。

2）研究OPS對(duì)各種微生物細(xì)胞的作用方式，探討其作用機(jī)理。

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Antibacterial Activity of Opuntia and Its Polysaccharide to Some Contaminated Microbes in Food

YUAN Hai-na1,2

（1.School of Biological and Chemical Engineering,Zhejiang University of Science and Technology,Hangzhou 310023,Zhejiang,China;2.Zhejiang Provincial Key Lab for Chemical and Biological Processing Technology of Farm Product,Hangzhou 310023,Zhejiang,China）>

The conventional method of water extraction and ethanol precipitation was applied to prepared polysaccharide from opuntia (OPS)powder.The interference of trichloroacetic acid to antibacterial activity of OPS which was used to eliminate the foreign protein was discussed.The inhibition ability of OPS and opuntia powder to some common contaminated microbes was studied by means of tube disc method and mixture spread plate method.The results showed that trichloroacetic acid was the mainly factor to false positive antibacterial reaction of OPS.It could be removed away OPS by using glycol solvent.The antibacterial activity of OPS and opuntia powder to S.aureus and S.cerevisiae was superior to E.coli and P.frequentans.With respect to viscous bacteriostatic agent,the mixture spread plate method was preferable to the tube disc method.

opuntia polysaccharide;antibacterial experimental method;antibacterial effect

袁海娜（1978—），女（漢），高工，博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品生物與化學(xué)深加工研究。

浙江省教育廳一般項(xiàng)目（Y200804548）

2011-12-10