S n-2位富含棕櫚酸甘油三酯的酶法制備研究

馮永方，韋 偉，童靜靜，馮鳳琴，*，宋俊梅，*

（1.山東輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250353；2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058）

棕櫚油是世界上廣泛應(yīng)用的一種食用植物油，主要產(chǎn)自馬來西亞和印度尼西亞等地[1-2]。棕櫚油經(jīng)分提可得到熔點(diǎn)不同的棕櫚液油、棕櫚超級(jí)液油和棕櫚硬脂。不同棕櫚油中脂肪酸的含量與分布相差較大，其中棕櫚硬脂中棕櫚酸含量最高，可達(dá)到48%～74%[3]。但其中的棕櫚酸主要分布在Sn-1，3位上，Sn-2位主要分布的是油酸，與母乳脂肪的脂肪酸分布相反[4]。母乳是目前嬰兒最理想的食品，但由于一些特殊原因?qū)е聼o法進(jìn)行母乳喂養(yǎng)時(shí)，嬰幼兒配方奶粉成為一種較為理想的選擇[5]。研究發(fā)現(xiàn)，母乳中含有3.0%～4.5%的脂肪，卻是嬰兒50%左右能量得來源，由于其特殊的脂肪酸組成和分布，對(duì)維生素及礦物質(zhì)的吸收起到了關(guān)鍵作用[6-7]。母乳脂肪中棕櫚酸含量在20%～25%左右，其中70%左右的棕櫚酸分布在甘油三酯的Sn-2位[8-9]。而市售的嬰幼兒配方奶粉中的油脂主要是通過植物油調(diào)配而成，雖然脂肪酸含量及組成可做到與母乳相近，但Sn-2位棕櫚酸含量卻與母乳相差較大[10]。在體內(nèi)脂肪酶的作用下，配方奶粉中甘油三酯分解為Sn-1，3位的游離脂肪酸和Sn-2位的單甘酯。熔點(diǎn)高于人體溫度的游離棕櫚酸在堿性環(huán)境的小腸內(nèi)與鈣、鎂等礦物質(zhì)容易形成不溶性的皂化物，直接排除體外，從而造成了鈣質(zhì)的大量流失以及使嬰幼兒糞便硬度增加，導(dǎo)致嬰幼兒便秘和腹痛，甚至引發(fā)腸梗阻[11-12]。因此，對(duì)動(dòng)植物油脂的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造和優(yōu)化，制備可替代母乳脂肪的結(jié)構(gòu)油脂，是改善嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)和健康的必然趨勢(shì)。在我國(guó)，目前制備母乳脂肪替代油脂的主要原料為豬油，但因?yàn)轱L(fēng)俗習(xí)慣以及宗教忌諱問題，除了日本個(gè)別品牌的嬰兒配方奶粉中使用了豬油外，其他國(guó)家和地區(qū)都沒有把豬油用在嬰幼兒配方奶粉中，因此以豬油生產(chǎn)的產(chǎn)品的市場(chǎng)潛力遠(yuǎn)小于用植物油為原料生產(chǎn)的產(chǎn)品。植物油中當(dāng)屬棕櫚油富含棕櫚酸，但棕櫚酸主要分布在Sn-1，3位，因此，對(duì)棕櫚油的Sn-2位棕櫚酸進(jìn)行富集是制備母乳脂肪替代油脂的前提。本研究采用有機(jī)溶劑體系，以非專一性脂肪酶為催化劑，催化棕櫚酸與棕櫚硬脂進(jìn)行酸解反應(yīng)，以提高Sn-2位棕櫚酸含量，為下一步制備母乳脂肪替代油脂提供原料。采用響應(yīng)面分析法（RSM），可以通過較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)獲得較滿意的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棕櫚硬脂 金光食品有限公司，其熔點(diǎn)為49℃[13]，脂肪酸組成見表1；Novozym 435非專一性脂肪酶 諾維信公司，酶活為10000PLU/g；豬胰脂酶 Sigma公司，酶活為12700U/g；2，7-二氯熒光素 西域科技（中國(guó)）；三羥甲基甲胺 上海傳信化工有限公司；GF254硅膠 青島海洋化工有限公司；膽酸鈉（生化試劑）、棕櫚酸、正己烷、無水乙醚、95%乙醇、氯化鈣、鹽酸、氫氧化鉀 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純；甲醇、正己烷 天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司，色譜純；甲酸 宜興市第二化學(xué)試劑廠，分析純。

GC-6890型氣相色譜儀（配有氫火焰離子化檢測(cè)器）、DB-23型毛細(xì)管色譜柱 安捷倫科技有限公司；THZ-82型水浴恒溫振蕩器 中國(guó)金壇市精達(dá)儀器制造廠；BSA224S型電子分析天平 德國(guó)賽多利集團(tuán)；SB-2型薄層色譜噴霧泵 中國(guó)天津市天分分析儀器廠。

表1 棕櫚硬脂中脂肪酸組成（%）Table 1 Composition of fatty acid in palm stearin（%）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

酶法酯交換方法：在25mL的圓底燒瓶中加入一定質(zhì)量比的棕櫚酸和棕櫚硬脂，加一定量的正己烷，在一定溫度的水浴恒溫振蕩器中振蕩10min，使反應(yīng)體系達(dá)到預(yù)定的反應(yīng)溫度，然后加入一定量的非專一性脂肪酶，反應(yīng)一定時(shí)間后，過濾除去脂肪酶以終止反應(yīng)，除去游離脂肪酸后對(duì)產(chǎn)物中甘油三酯進(jìn)行分析。

典型反應(yīng)：在25mL的圓底燒瓶中加入0.25g棕櫚酸、0.25g棕櫚硬脂、一定量正己烷和50mg Novozym 435，溫度為55℃，以一定轉(zhuǎn)速搖床反應(yīng)12h[15]。

1.2.1 色譜條件 色譜柱：DB-23石英毛細(xì)柱（60m×0.25mm×0.25μm）；汽化室溫度：250℃；檢測(cè)器FID溫度250℃；升溫程序：160℃以20℃/min升至180℃，保持6min，以20℃/min升至220℃，保持5min，以20℃/min升至230℃，保持10.5min；氫氣流量：40mL/min；空氣流量：400mL/min；載氣（N2）流速1.16mL/min，壓力27.947psi；進(jìn)樣量1.0μL；分流比50∶1。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)轉(zhuǎn)速、溶劑量、底物質(zhì)量比、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、加酶量和水分含量進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，然后在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)并確定了Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)及步長(zhǎng)，最后進(jìn)行了四因素三水平的29組響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表如表2所示。

表2 響應(yīng)面分析因素與水平表Table 2 Factors and levels of response surface analysis

1.2.3 產(chǎn)物純化 將反應(yīng)后的混合物溶解在一定量的正己烷中，加一定體積的0.5moL/L的氫氧化鉀水醇（水∶乙醇=7∶3，v∶v）溶液在70℃的條件下除酸，將上層有機(jī)相移入2mL離心管中以待下一步分析[16]。

將純化后的產(chǎn)物進(jìn)行薄層層析（TLC），對(duì)最終產(chǎn)物中成分進(jìn)行分析。

1.2.4 測(cè)定方法 總脂肪酸的測(cè)定：將油脂溶解在正己烷中，加入氫氧化鉀甲醇溶液通過酯交換甲酯化，反應(yīng)完全后，用硫酸氫鈉中和剩余的氫氧化鉀，以避免甲酯皂化[17]，待鹽沉淀后，將上層有機(jī)相進(jìn)樣，經(jīng)過氫火焰離子化檢測(cè)器（GC-FID）進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得油脂中總脂肪酸組分含量[18]。

Sn-2位脂肪酸的測(cè)定：將試樣中游離脂肪酸中和后，取一定量的油脂（如果油脂的熔點(diǎn)高于45℃，需將其溶解在正己烷中），用豬胰脂酶將甘油三酯水解成2-單甘酯，經(jīng)過薄層層析（TLC）分離[19-20]，刮下單甘酯條帶，將單甘酯溶解在正己烷中，用總脂肪酸測(cè)定同樣的方法和步驟測(cè)得油脂中Sn-2位脂肪酸組分含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)采用3次重復(fù)取平均值，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用SPSS（version 17.0）軟件中One-Way ANOVA進(jìn)行顯著性分析，在p＜0.05水平上差異顯著性，用不同字母表示；在p＞0.05水平上差異無顯著性，用相同字母表示。使用Origin Pro 8.0軟件進(jìn)行制圖，采用Design Expert 7進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析。

2 結(jié)果與討論

通過薄層層析（TLC）分析發(fā)現(xiàn)棕櫚硬脂除甘油三酯外，存在少量的甘油二酯，且無單甘酯的存在，如圖1（左）所示。將酶法酯交換反應(yīng)后的產(chǎn)物經(jīng)過0.5moL/L的氫氧化鉀水醇（水∶乙醇=7∶3，v∶v）溶液在70℃的條件下除酸后，經(jīng)薄層層析（TLC）分析發(fā)現(xiàn)反應(yīng)產(chǎn)物中只有甘油三酯，如圖1（右）所示。因此，純化后的最終產(chǎn)物中無單甘酯和甘油二酯的存在，這是因?yàn)樵诜磻?yīng)過程中，棕櫚酸與非甘油三酯成分在非專一性脂肪酶的作用下發(fā)生了反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為甘油三酯。所以，在以下實(shí)驗(yàn)分析中，所述的Sn-2位棕櫚酸含量即為甘油三酯中的含量。

圖1 棕櫚硬脂（左）與最終產(chǎn)物（右）的TLC圖譜比較Fig.1 Comparison of TLC map between palm stearin（left） and final product（right）

2.1 酶法酯交換單因素條件優(yōu)選

2.1.1 轉(zhuǎn)速對(duì)棕櫚酸含量與分布的影響 在25mL的圓底燒瓶中加入0.25g棕櫚酸、0.25g棕櫚硬脂、5mL/g反應(yīng)混合物的正己烷和50mg非專一性脂肪酶Novozym 435，在55℃條件下，分別以150、175、200、225r/min不同轉(zhuǎn)速搖床反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后，過濾除酶除酸，采用氣相色譜法分別測(cè)定每個(gè)樣品中總棕櫚酸和Sn-2位棕櫚酸含量，結(jié)果見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)物中棕櫚酸分布的影響Fig.2 Impact of speed on the distribution of the palm acid in the products

由圖2可見，轉(zhuǎn)速對(duì)總棕櫚酸含量的影響較小，大于200r/min時(shí)總棕櫚酸含量有所降低。但不同轉(zhuǎn)速對(duì)Sn-2位棕櫚酸含量的影響較大，當(dāng)轉(zhuǎn)速為200r/min時(shí)，產(chǎn)物中Sn-2位棕櫚酸到達(dá)最大值為58.96%。因此，選擇轉(zhuǎn)速200r/min較適合。

2.1.2 溶劑量對(duì)棕櫚酸含量與分布的影響 在25mL的圓底燒瓶中加入0.25g棕櫚酸、0.25g棕櫚硬脂和50mg非專一性脂肪酶Novozym 435，在55℃條件下，分別加4、6、8、10、12、14mL/g反應(yīng)混合物的正己烷，在200r/min的轉(zhuǎn)速下?lián)u床反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后，過濾除酶，采用氣相色譜法分別測(cè)定每個(gè)樣品中總棕櫚酸和Sn-2位棕櫚酸含量，結(jié)果見圖3。

圖3 溶劑量對(duì)產(chǎn)物中棕櫚酸分布的影響Fig.3 Impact of solvent quantity on the distribution of the palm acid in the products

由圖3可見，溶劑量對(duì)總棕櫚酸和Sn-2位棕櫚酸含量都有一定程度的影響，都有先升后降的趨勢(shì)。溶劑量較小時(shí)，可能由于熔點(diǎn)為63℃的棕櫚酸溶解性差使得反應(yīng)速率慢；但當(dāng)溶劑量較大時(shí)，由于酶與底物的接觸機(jī)會(huì)降低，從而影響了反應(yīng)速率。當(dāng)溶劑量為8mL/g反應(yīng)混合物時(shí)，產(chǎn)物中總棕櫚酸和Sn-2位棕櫚酸含量同時(shí)達(dá)到最高值，分別為69.76%和62.41%。因此，選擇溶劑量為8mL/g反應(yīng)混合物最為適合。

2.1.3 底物質(zhì)量比對(duì)棕櫚酸含量與分布的影響 在25mL的圓底燒瓶中加入0.25g棕櫚硬脂、50mg非專一性脂肪酶Novozym 435，棕櫚酸與棕櫚硬脂按0.25∶1、0.5∶1、0.75∶1、1∶1、1.25∶1和1.5∶1（均為質(zhì)量比）加入，分別加入8mL/g反應(yīng)混合物的正己烷，在55℃條件下，以200r/min的轉(zhuǎn)速搖床反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后，過濾除酶除酸，采用氣相色譜法分別測(cè)定每個(gè)樣品的總棕櫚酸和Sn-2位棕櫚酸含量，結(jié)果見圖4。

圖4 底物質(zhì)量比對(duì)產(chǎn)物中棕櫚酸分布的影響Fig.4 Impact of substrate quality ratio on the distribution of the palm acid in the products

由圖4可見，隨著棕櫚酸含量的增加，產(chǎn)物中總棕櫚酸含量一直呈上升趨勢(shì)；但Sn-2位棕櫚酸先緩慢上升，在底物質(zhì)量比為1∶1時(shí)出現(xiàn)最高值，當(dāng)棕櫚酸含量繼續(xù)上升時(shí)，Sn-2位棕櫚酸反而下降，且下降趨勢(shì)明顯。這可能是因?yàn)榇罅孔貦八岬拇嬖谟绊懥酥久笇?duì)Sn-2位的作用。因此，選擇底物質(zhì)量比1∶1最為適合。

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)棕櫚酸含量與分布的影響 在25mL的圓底燒瓶中加入0.25g棕櫚酸、0.25g棕櫚硬脂、50mg非專一性脂肪酶Novozym 435和8mL/g反應(yīng)混合物的正己烷，在55℃條件下，以200r/min的轉(zhuǎn)速分別搖床反應(yīng)6、12、18、24、30、36、42、48h。反應(yīng)結(jié)束后，過濾除酶除酸，采用氣相色譜法分別測(cè)定每個(gè)樣品的總棕櫚酸和Sn-2位棕櫚酸含量，結(jié)果見圖5。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)物中棕櫚酸分布的影響Fig.5 Impact of reaction time on the distribution of the palm acid in the products

由圖5可見，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，總棕櫚酸含量前24h呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，隨后呈現(xiàn)波動(dòng)狀態(tài)；而Sn-2位棕櫚酸前24h上升幅度較大，24h后上升比前階段緩慢，在42h有下降現(xiàn)象出現(xiàn)。這可能是因?yàn)榉磻?yīng)到達(dá)一定時(shí)間后，反應(yīng)體系中脂肪酸到達(dá)平衡。在反應(yīng)時(shí)間為36h時(shí)，總棕櫚酸和Sn-2位棕櫚酸含量分別達(dá)到最大值為77.38%和77.50%。

2.1.5 反應(yīng)溫度對(duì)棕櫚酸含量與分布的影響 在25mL的圓底燒瓶中加入0.25g棕櫚酸、0.25g棕櫚硬脂、50mg非專一性脂肪酶Novozym 435、8mL/g反應(yīng)混合物的正己烷，分別在45、50、55、60、65℃條件下，以200r/min的轉(zhuǎn)速分別搖床反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后，過濾除酶除酸，采用氣相色譜法分別測(cè)定每個(gè)樣品的總棕櫚酸和Sn-2位棕櫚酸含量，結(jié)果見圖6。

圖6 反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)物中棕櫚酸分布的影響Fig.6 Impact of reaction temperature on the distribution of the palm acid in the products

由圖6可見，隨著溫度的升高，總棕櫚酸和Sn-2位棕櫚酸含量都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，Sn-2位棕櫚酸上升幅度大于總棕櫚酸的上升幅度。在不考慮脂肪酶使用次數(shù)的前提下，溫度越高越好；但當(dāng)溫度達(dá)到一定高度時(shí)會(huì)影響酶活，考慮到酶的使用次數(shù)和生產(chǎn)周期的問題，選擇50～60℃較為合適。

2.1.6 加酶量對(duì)棕櫚酸含量與分布的影響 在25mL的圓底燒瓶中加入0.25g棕櫚酸、0.25g棕櫚硬脂和8mL/g反應(yīng)混合物的正己烷，分別加入10%、15%、20%、25%、30%和35%（以棕櫚硬脂質(zhì)量計(jì)）的非專一性脂肪酶Novozym 435，在55℃條件下，以200r/min的轉(zhuǎn)速搖床反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后，過濾除酶，采用氣相色譜法分別測(cè)定每個(gè)樣品的總棕櫚酸和Sn-2位棕櫚酸含量，結(jié)果見圖7。

圖7 加酶量對(duì)產(chǎn)物中棕櫚酸分布的影響Fig.7 Impact of enzyme load on the distribution of the palm acid in the products

由圖7可見，隨著加酶量的增加，總棕櫚酸含量先升高后下降，但Sn-2位棕櫚酸含量一直處于上升趨勢(shì)?？紤]到非專一性脂肪酶成本高的問題，所以選擇上升幅度最大的15%～25%作為研究區(qū)域。

2.1.7 水分含量對(duì)棕櫚酸含量與分布的影響 在25mL的圓底燒瓶中加入0.25g棕櫚酸、0.25g棕櫚硬脂、50mg非專一性脂肪酶Novozym 435、8mL/g反應(yīng)混合物的正己烷，分別加入0%、3%、6%、9%、12%、15%和18%（以非專一性脂肪酶質(zhì)量計(jì)）去離子水，在55℃條件下，以200r/min的轉(zhuǎn)速搖床反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后，過濾除酶除酸，采用氣相色譜法分別測(cè)定每個(gè)樣品的總棕櫚酸和Sn-2位棕櫚酸含量，結(jié)果見圖8。

圖8 水分含量對(duì)產(chǎn)物中棕櫚酸分布的影響Fig.8 Impact of moisture content on the distribution of the palm acid in the products

由圖8可見，隨著水分含量的增加，總棕櫚酸和Sn-2位棕櫚酸含量在3%下有稍微的升高后一直呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中Sn-2位棕櫚酸含量下降趨勢(shì)非常明顯。與不加水相比，Sn-2位棕櫚酸含量上升程度很小，考慮到操作復(fù)雜問題，所以在響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中選擇不加水。

2.2 酶法酯交換響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

2.2.1 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) 響應(yīng)面擬合方程僅在考察的臨近區(qū)域才可與真實(shí)情況近似，因此，應(yīng)先逼近Sn-2位棕櫚酸含量達(dá)到60%區(qū)域后再建立有效的擬合方程。由單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取底物質(zhì)量比（A）、反應(yīng)時(shí)間（B）、反應(yīng)溫度（C）和加酶量（D）四個(gè)對(duì)Sn-2位棕櫚酸含量（Y）影響較大的因素進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)。由于非專一性脂肪酶高昂的價(jià)格及在較高溫度下容易失活的特點(diǎn)，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[15]及廠家提供的信息，選擇加酶量20%（以棕櫚硬脂質(zhì)量計(jì)）和反應(yīng)溫度55℃作為的中心點(diǎn)，在此溫度及加酶量下的生產(chǎn)成本較低。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)它們的步長(zhǎng)，具體見表3。由表3可以看出，在2階段組合實(shí)驗(yàn)的響應(yīng)值最接近60%，所以選擇2階段組合實(shí)驗(yàn)作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的中心實(shí)驗(yàn)點(diǎn)。

表3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and result of steepest ascent experiment

2.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)及最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定酯交換反應(yīng)的適宜底物質(zhì)量比、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和加酶量的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以底物質(zhì)量比（A）、反應(yīng)時(shí)間（B）、反應(yīng)溫度（C）和加酶量（D）為自變量，以產(chǎn)物中Sn-2位棕櫚酸含量為響應(yīng)值（Y），設(shè)計(jì)四因素三水平共29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，建立二次多項(xiàng)式回歸模型，根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，對(duì)29組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行回歸擬合，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

表4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and result of Box-Behnken experiment

2.2.3 回歸模型建立及方差分析 利用Design Expert軟件，通過多項(xiàng)式回歸分析和逆向消除分析方法對(duì)表4實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，獲得Sn-2位棕櫚酸含量（Y）對(duì)自變量底物質(zhì)量比（A）、反應(yīng)時(shí)間（B）、反應(yīng)溫度（C）和加酶量（D）的二次多項(xiàng)回歸方程：

由表5方差分析結(jié)果可以看出，本實(shí)驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型極顯著（p＜0.0001），其中，B、C、D對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有極顯著的影響，C2達(dá)到高度顯著水平，A、B2達(dá)到顯著水平；方程的失擬項(xiàng)不顯著（p=0.2074），說明各因素值和響應(yīng)值之間的關(guān)系可以用此模型來函數(shù)化。相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.9367，表明Sn-2位棕櫚酸含量的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度。其校正決定系數(shù)R2=0.9683，表明僅有約3.2%的Sn-2位棕櫚酸含量的總變異不能由此模型進(jìn)行解釋。

表5 方差分析表Table 5 Variance of analysis

從四個(gè)因素對(duì)Sn-2位棕櫚酸含量的影響來看，回歸方程的一次項(xiàng)A、B、C、D對(duì)Sn-2位棕櫚酸含量的線性效應(yīng)顯著，且影響順序A＜B=C=D；二次項(xiàng)B2和C2對(duì)Sn-2位棕櫚酸的曲面效應(yīng)顯著，而其他二次項(xiàng)和兩兩因素間的交互作用不顯著。

當(dāng)Sn-2位棕櫚酸含量達(dá)到60%時(shí)，即可作為下一步制備母乳化結(jié)構(gòu)油脂的原料。通過響應(yīng)面優(yōu)化得到Sn-2位棕櫚酸含量達(dá)到60%時(shí)的最佳工藝條件為：棕櫚酸與棕櫚硬脂質(zhì)量比1.09∶1，反應(yīng)時(shí)間9.9h，反應(yīng)溫度54.7℃，加酶量21.9%。采用上述優(yōu)化后的條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，三次平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)得產(chǎn)物中Sn-2位棕櫚酸含量平均值為60.59%，與理論預(yù)測(cè)值基本吻合。

3 結(jié)論

棕櫚酸與棕櫚硬脂在非專一性脂肪酶Novozym 435的催化下進(jìn)行酸解反應(yīng)，棕櫚硬脂中Sn-2位棕櫚酸得到大幅度提高，得到的甘油三酯完全可以滿足下一步制備母乳化結(jié)構(gòu)油脂的要求。通過單因素實(shí)驗(yàn)，得到最佳轉(zhuǎn)速為200r/min，溶劑量為8mL/g反應(yīng)混合物。四因素三水平的響應(yīng)面分析得到的產(chǎn)物Sn-2位棕櫚酸含量為44%～78%。下一步制備母乳脂肪替代油脂時(shí)，根據(jù)產(chǎn)物的指標(biāo)要求不同，可選取不同的條件制備得到Sn-2位棕櫚酸含量不同的甘油三酯。在最優(yōu)工藝條件為：棕櫚酸與棕櫚硬脂質(zhì)量比1.09∶1，反應(yīng)時(shí)間9.9h，反應(yīng)溫度54.7℃，加酶量21.9%時(shí)，甘油三酯中Sn-2位棕櫚酸含量可達(dá)到60.59%。

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