活血化瘀法對慢性盆腔炎雌性大鼠血清前炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-8水平的影響

師偉 劉瑞芬 楊曉娜 徐麗

炎癥細胞因子網絡中，活化內皮細胞、單核細胞分泌的細胞因子和炎性介質能激活細胞核轉錄因子，促使更多細胞因子釋放，擴大炎癥反應。前炎癥細胞因子是炎癥反應的生理信使分子，當炎癥反應失控時損傷組織，被證實與急慢性炎癥疼痛的產生密切相關[1]。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是具有廣泛生物活性的前炎癥細胞因子，感染、創(chuàng)傷時，TNF-α可升高[1]；作為急性炎癥反應的關鍵介質白介素-1β（IL-1β），是啟動抗菌炎性反應的關鍵細胞因子之一[2]；白介素-8（IL-8）能幫助募集中性粒細胞和單核細胞進入炎癥部位、調節(jié)白細胞黏附分子的表達[3]。因此，三者血清水平的變化，會影響機體炎癥反應程度和性質，從而影響慢性盆腔炎的發(fā)展和結局。本研究旨在從前炎癥細胞因子方面，探討活血化瘀法防治慢性盆腔炎的作用機理。

1 材料與方法

1.1 動物選擇及分組 選擇SPF級Wistar雌性成年大鼠60只，體重（200±20）g（山東大學實驗動物中心提供，SCXK【魯】20030004），常規(guī)飼養(yǎng)一周，適應環(huán)境后，按體重隨機分為慢性盆腔炎造模組（模型組），桂枝茯苓膠囊治療高、中、低劑量組（高、中、低劑量實驗組），少腹逐瘀膠囊治療組（對照組），各組均為12只，另選假手術慢性盆腔炎造模大鼠（假手術組）、正常飼養(yǎng)未干預大鼠（正常組）各12只。

1.2 實驗試劑

1.2.1 大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-8的ELISA檢測試劑盒（美國ADL公司生產）。

1.2.2 菌液配制 將大腸桿菌（山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院菌種室提供）、乙型溶血性鏈球菌（山東省衛(wèi)生防疫站提供）和金黃色葡萄球菌（山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院菌種室提供）按2:1:1分別接種于血平板35 ℃，24 h后，稀釋菌液，無菌生理鹽水2 ml，分別取經24 h培養(yǎng)的菌株數(shù)個，用標準麥氏管（相當30億個菌）比濁，制成濃度30億/ml的混合細菌懸液。

1.2.3 實驗藥物 桂枝茯苓膠囊（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司生產，國藥準字Z10950005），用蒸餾水制成31 mg/ml懸濁液；少腹逐瘀膠囊（東阿澳東藥業(yè)有限公司生產，國藥準字Z20000085），用蒸餾水制成45 mg/ml懸濁液。

1.3 實驗方法及指標檢測 采用混合細菌加機械損傷造模法[4]，大鼠腹腔麻醉取仰臥位，取下腹正中切口1 cm，暴露并固定子宮，每側宮腔內注入0.1 ml菌液，注入前注射器機械損傷子宮內膜組織；假手術組動物開腹后，雙側宮腔內分別注入0.1 ml無菌蒸餾水關腹，術后均不使用抗生素。高、中、低劑量實驗組分別按臨床2倍、1倍、1/2倍劑量，每天給予桂枝茯苓膠囊配制液502、251、125 mg/kg灌胃；對照組按臨床等效劑量，每天給予少腹逐瘀膠囊配制液364 mg/kg灌胃。模型組、假手術組、正常組予蒸餾水灌胃，每100克灌胃1 ml/d。各組均為造模后第22天開始灌胃，連續(xù)14 d。

給藥后第15天清晨禁食，1%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔麻醉后，心臟取血8 ml，抗凝離心每分鐘3000 r取上清液，-30 ℃以下保存，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）檢測血清指標（按ELISAkit操作說明進行）。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 12.0軟件統(tǒng)計，計量資料以（±s）表示，采用F檢驗和t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠用藥結束后血清TNF-α檢測比較 模型組血清TNF-α水平較正常組、假手術組明顯升高（P<0.01）；中劑量實驗組較模型組明顯降低（P<0.01），且接近正常組水平（P>0.05），對照組較正常組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；中劑量實驗組較對照組降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），高劑量實驗組較對照組升高，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），低劑量實驗組較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；中劑量實驗組血清TNF-α水平，較高、低劑量實驗組明顯降低（P<0.01），高劑量實驗組較低劑量實驗組亦明顯降低（P<0.01）。見表1。

表1 各組大鼠用藥結束后血清TNF-α檢測比較

2.2 各組大鼠用藥結束后血清IL-1β檢測比較 血清IL-1β水平，模型組較正常組、假手術組明顯升高（P<0.01）；高、中劑量實驗組、對照組較模型組明顯降低（P<0.01），且接近正常組水平（P>0.05）；高、中劑量實驗組較對照組降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），低劑量實驗組較對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；高、中劑量實驗組血清IL-1β水平，較低劑量實驗組明顯降低（P<0.01），中劑量實驗組較高劑量實驗組降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

表2 各組大鼠用藥結束后血清IL-1β檢測比較

2.3 各組大鼠用藥結束后血清IL-8檢測比較 模型組血清IL-8水平較正常組、假手術組明顯升高（P<0.01）；中劑量實驗組較模型組明顯降低（P<0.01），且接近正常組水平（P>0.05）；對照組較正常組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；中劑量實驗組較對照組降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），高劑量實驗組較對照組升高，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），低劑量實驗組較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；中劑量實驗組血清IL-8水平，較高、低劑量實驗組明顯降低（P<0.01），高劑量實驗組較低劑量實驗組亦降低（P<0.05）。見表3。

表3 各組大鼠用藥結束后血清IL-8檢測比較

3 討論

3.1 前炎癥細胞因子對炎癥發(fā)展和結局的影響 前炎癥細胞因子廣泛參與機體免疫、炎癥、感染等反應，影響疾病的預后，其中TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8等是重要的前炎癥細胞因子，可觸發(fā)炎癥細胞因子網絡級聯(lián)反應，進一步與血小板激活因子、白三烯、氧自由基、一氧化氮等炎癥介質共同作用，推動疾病發(fā)生發(fā)展[5-6]。

TNF-α作為活化單核-巨噬細胞產生的一種重要細胞因子，在感染性疾病和炎癥方面，能刺激血管內皮細胞表達黏附分子、刺激單核-巨噬細胞和其他細胞分泌趨化性細胞因子，引起白細胞在炎癥部位聚集，促進炎癥反應，適量TNF-α增進機體免疫功能，調節(jié)多種免疫細胞共同殺滅和消除入侵的致病原，過度反應的過量TNF-α，則產生劇烈免疫反應，呈現(xiàn)毒性作用，對機體造成損害[7]。IL-1β是旁分泌型細胞因子，能調節(jié)炎癥反應中纖維蛋白沉積和溶解，增加成纖維細胞膠原酶的產生，刺激成纖維細胞增殖，促進膠原沉積。Wiczyk等[8]發(fā)現(xiàn)腹部大手術后患者的早期血清IL-1、TNF-α水平與術后腸粘連、腹腔內粘連有顯著聯(lián)系，認為IL-1和TNF-α術后早期升高，可作為人類術后腹膜粘連形成的可靠生物學標志。Hershlag等[9]實驗證明，IL-1是術后腹膜粘連形成的重要短期介質。IL-8在炎癥刺激后由巨噬細胞、內皮細胞和其他細胞產生，主要特點是幫助募集中性粒細胞、單核細胞進入炎癥部位，調節(jié)白細胞黏附分子的表達[10]，導致粒細胞浸潤、聚集、黏附、脫顆粒，釋放溶酶體，呼吸爆發(fā)等，參與水腫、滲出等各種炎癥過程，與免疫性炎癥、感染性疾病、休克等密切相關[11]。

本研究結果顯示，血清TNF-α、IL-1β、IL-8水平增高，與大鼠慢性盆腔炎造模密切相關，造模后37 d的模型組，三項指標仍處于異常增高水平，可能反映了局部過度的炎癥反應。藥物干預后，血清TNF-α、IL-1β、IL-8水平均能降低，且降低幅度大，接近正常組指標的組別，其子宮大體形態(tài)學、組織病理學改變越接近正常組和假手術組，這與筆者實驗觀察結果較一致[12]。因此，推斷TNF-α、IL-1β、IL-8可能在慢性盆腔炎發(fā)展和結局中發(fā)揮重要作用，早期糾正其異常增高的水平，可能是防治慢性盆腔炎的重要環(huán)節(jié)之一。

3.2 活血化瘀法對前炎癥細胞因子的作用 具有活血化瘀功效的中藥方劑，能通過多環(huán)節(jié)調整炎癥發(fā)展過程，對前炎癥細胞因子的作用是其調節(jié)炎癥網絡因子的主要方面之一。劉淑清等[13]證實，益氣補腎活血方可通過抑制與骨破壞密切相關的細胞因子TNF-α和IL-1水平，可能是治療類風濕關節(jié)炎的作用機制之一。胡波等[14]研究提示，活血補腎方通過對IL-8、SIgA分泌量的調節(jié)起到調節(jié)免疫作用，從而對ⅢA型前列腺炎大鼠起治療作用。慢性盆腔炎（CPID）是指女性盆腔生殖器官及其周圍結締組織、盆腔腹膜發(fā)生的慢性炎癥性病變，西醫(yī)婦產科學七年制教材統(tǒng)稱為盆腔炎癥性疾病后遺癥，現(xiàn)代中醫(yī)婦科學認為，血瘀是本病病機的關鍵所在。本研究干預藥物選用臨床確有療效的婦科經典活血化瘀方劑桂枝茯苓膠囊、少腹逐瘀膠囊，實驗結果表明，其作用機理與降低血清TNF-α、IL-1β、IL-8水平，使其接近正常，糾正過度炎癥反應密切相關，并與藥物劑量存在一定相關性。桂枝茯苓膠囊中劑量組（相當于臨床用量）效果明顯，可見活血化瘀法通過下調前炎癥細胞因子，減輕和消除炎癥損傷，抑制炎癥發(fā)展可能是其防治慢性盆腔炎的主要機理之一。

下一步研究思路：一是桂枝茯苓膠囊的劑量大小與其對慢性盆腔炎大鼠血清前炎癥細胞因子降調節(jié)的程度，呈現(xiàn)非正比關系，這可能與炎癥調控平衡點及實驗偏倚有關，需開展更為精確的不同劑量對比實驗及可靠性高的重復性試驗。二是活血化瘀法防治本病血清前炎癥細胞因子之間的變化關系，也有待進一步探討。

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