一株耐高溫乳酸菌的發(fā)酵條件優(yōu)化

王玉，吳疆，吳家鑫

（1.天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)系，天津 300384；2.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司獸藥研究所，北京 100091）

乳酸是世界上公認(rèn)的三大有機(jī)酸之一，是重要的生物化工產(chǎn)品，在醫(yī)藥、食品等工業(yè)有廣泛的應(yīng)用[1]。它也是制造無(wú)毒的高分子化合物聚L-乳酸的單體，且聚L-乳酸具有良好的生物相容性，強(qiáng)度高，可塑性加工成型，不污染環(huán)境因而被認(rèn)為是最有前途的可生物降解高分子材料[2]。在乳酸發(fā)酵工業(yè)中，利用高溫乳酸菌可以縮短生產(chǎn)周期、節(jié)約冷卻用水，減少污染的可能性。

本文將Plackett-Burman設(shè)計(jì)與Box-Benhnken設(shè)計(jì)相結(jié)合，并運(yùn)用SAS軟件對(duì)一株能夠耐受55℃高溫的乳酸菌發(fā)酵乳酸的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。

1 儀器、材料與方法

1.1 儀器

飛鴿牌系列離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；座式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；生化培養(yǎng)箱（55℃）：江蘇金壇市宏凱儀器廠；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電子天平：梅特勒－托利多儀器(上海）有限公司；旋轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜：上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；生物傳感分析儀SBA-40C：山東省科學(xué)院。

1.2 耐高溫乳酸菌LA-55

由天津農(nóng)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室篩選保藏。

1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 50、蛋白胨 10、酵母膏5、牛肉膏 10、乙酸鈉 5、MgSO4·2H2O 0.2、MnSO4·4H2O 0.038、檸檬酸二胺 2、K2HPO42、CaCO317，pH6.5。

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 30、蛋白胨 10、酵母膏10、牛肉膏 10、乙酸鈉 5、MgSO4·2H2O 0.2、MnSO4·4H2O 0.2、檸檬酸二胺 2、K2HPO40.2、CaCO320、吐溫 801，pH6.8。

發(fā)酵培養(yǎng)基：初始發(fā)酵培養(yǎng)基同種子培養(yǎng)基，在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，各成分的量隨設(shè)計(jì)的不同而不同。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 L-乳酸的發(fā)酵

將斜面3～4環(huán)接于裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，55℃下120 r/min培養(yǎng)12 h即為種子液。以10%（體積比）的接種量接種于裝50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，55℃，120 r/min搖床培養(yǎng)36 h。發(fā)酵培養(yǎng)基成分根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案逐次改變。

1.4.2 分析方法

采用生物傳感分析儀。

1.4.3 Plackett-Burman設(shè)計(jì)

采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)可以在多種因素存在的條件下評(píng)價(jià)各因素之間的相對(duì)重要性[3]。選用實(shí)驗(yàn)次數(shù)N=12的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)9個(gè)因素進(jìn)行考察，各因素對(duì)應(yīng)的水平取值見表1。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design g/L

1.4.4 Box-Benhnken設(shè)計(jì)

Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)是比較常用的響應(yīng)面分析法（RSA）方法，適用于2至5個(gè)因素的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)[4]。本實(shí)驗(yàn)在P-B實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙酸鈉，酵母膏，蛋白胨3個(gè)因素為自變量，設(shè)計(jì)了三因素三水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。各自變量的編碼值如表2所示。

表2 Box-Benhnken設(shè)計(jì)因素水平編碼表Table 2 Factors and levels of Box-Benhnken design g/L

2 結(jié)果與分析

2.1 L-乳酸發(fā)酵主要影響因素的確定

采用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)對(duì)前期實(shí)驗(yàn)篩選出的氮源、碳源和無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行優(yōu)化，選出對(duì)L-乳酸發(fā)酵有重要影響的因素，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表3。

表3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 The results of Plackett-Burman design

通過SAS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，各因素主效應(yīng)分析結(jié)果見表4。

表4 各因素的主效應(yīng)Table 4 Main effect of the factors

乙酸鈉在α=0.1水平上對(duì)L-乳酸產(chǎn)量有顯著影響，其他因素均不顯著。綜合實(shí)驗(yàn)分析，選擇排在前三位的乙酸鈉、酵母膏、蛋白胨進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 最適灰樹花胞外多糖發(fā)酵培養(yǎng)基的確定

2.2.1 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析

依據(jù)P-B實(shí)驗(yàn)和最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定的實(shí)驗(yàn)因素與水平，采用Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)產(chǎn)灰樹花發(fā)酵條件進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

運(yùn)用SAS軟件的RSREG（響應(yīng)面回歸）過程對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合見表6、表7。由表6可知，該回歸模型顯著，復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方R2=0.9210，因此通過SAS軟件分析得出的此回歸方程擬合程度較好。方差分析說明，各因素的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)顯著影響L-乳酸合成，說明響應(yīng)面分析所選的3個(gè)因素（乙酸鈉、酵母膏、蛋白胨）主效應(yīng)顯著。失擬檢驗(yàn)Pr=0.5038，不顯著，說明不需要引入更高次項(xiàng)，模型中無(wú)異常點(diǎn)，模型規(guī)定恰當(dāng)。擬合的二次回歸方程為：

表5 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 The results of Box-Benhnken design

表6 方差分析表Table 6 The results of variance analysis

表7 回歸模型系數(shù)估計(jì)Table 7 Estimated value of the regression coefficient

2.2.2 響應(yīng)面直觀分析

根據(jù)模型方程（回歸方程）可以作出響應(yīng)曲面圖及其等高線圖。它們可以比較直觀地解釋各變量和變量之間對(duì)響應(yīng)值的影響。圖1所示為蛋白胨（X3）、乙酸鈉（X1）和酵母膏（X2）對(duì)L-乳酸產(chǎn)量的影響模型的等高線圖。

圖1 響應(yīng)面分析的等高線圖Fig.1 Response plot

2.2.3 嶺脊分析

運(yùn)用SAS軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行嶺脊分析，尋求最大產(chǎn)乳酸量的穩(wěn)定點(diǎn)及對(duì)應(yīng)的因素水平，結(jié)合圖1給出回歸方程的三維響應(yīng)面圖和等高線圖可知，回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn)（－0.047723，0.101134，0.021758），乳酸產(chǎn)量的最大估計(jì)值為11.3473g/L。即各因素的真實(shí)值分別為：乙酸鈉1.69 g/L、酵母膏6.63 g/L、蛋白胨6.33 g/L，該模型預(yù)測(cè)的最大乳酸產(chǎn)量為11.3473 g/L。通過SAS軟件的分析，當(dāng)乙酸鈉1.69 g/L、酵母膏6.63 g/L、蛋白胨6.33 g/L時(shí)，回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn)，且為最大值，預(yù)測(cè)最大L-乳酸產(chǎn)量為11.3473 g/L。

2.2.4 模型驗(yàn)證

由于實(shí)驗(yàn)方案中沒有最適配方這個(gè)組合，需要對(duì)最適培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其產(chǎn)乳酸量為12.533 g/L，與模型預(yù)測(cè)相符，可見模型可較好的預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵情況。從而，確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：乙酸鈉 1.69 g/L、酵母膏 6.63 g/L、蛋白胨 6.33 g/L。比最初的產(chǎn)量7.2 g/L提高了74.07%，表明該模型是合適有效的，并具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

通過SAS軟件優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，通過Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)得出乙酸鈉、酵母膏、蛋白胨為影響乳酸產(chǎn)量的顯著因素；再經(jīng)過響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)得出最優(yōu)培養(yǎng)基配方：乙酸鈉1.69 g/L、酵母膏6.63 g/L、蛋白胨6.33g/L，使L-乳酸產(chǎn)量在55℃條件下由初始發(fā)酵條件下的7.2 g/L提高到12.533 g/L，提高百分比為74.07%，優(yōu)化結(jié)果非常顯著。

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[2]徐忠,汪群慧,姜兆華.L-乳酸的制備及其應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].化學(xué)與粘合,2004,214(4):214-217

[3]疏秀林,施慶珊,馮靜,等.γ-聚谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基的Plackett-Burman法優(yōu)化[J].生物技術(shù)通報(bào),2007(4):173-177

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