β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株篩選、誘變及其發(fā)酵的研究

潘艷，張益波，郭志敏，王詩雨，邢慧萌，林風(fēng)，滕利榮，侯阿澧

（吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130012）

β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21;β-D-Glucosidase）也叫纖維二糖酶，在不同生物中由多種同源酶組成，作用是從非還原性末端催化水解β-葡萄糖苷鍵釋放β-D-葡萄糖。β-葡萄糖苷酶在不同的生物體內(nèi)和生物技術(shù)應(yīng)用中都有重要的作用，這包括對生物質(zhì)的降解[1]；利用纖維秸稈類生產(chǎn)乙醇[2]；作為一種重要風(fēng)味酶，它能作用于茶葉、葡萄酒以及果汁中的風(fēng)味前體物質(zhì)，釋放出風(fēng)味成分，起到增香作用[3]；也是合成重要的糖配體[4]等。在纖維素酶的糖化過程中，纖維二糖對內(nèi)切纖維素酶和外切纖維素酶有很強的抑制作用，添加過量β-葡萄糖苷酶可以減緩這種競爭性抑制作用。

本文從玉米秸稈天然腐爛的腐土中篩選得到了一株能生產(chǎn)高效胞外β-葡萄糖苷酶的菌株。對此菌株進行紫外、化學(xué)、以及化學(xué)和紫外的復(fù)合誘變[5]，得到的UV-4-DES6具有生長速度快，利用工農(nóng)業(yè)廢料產(chǎn)酶高的特性，可能是解決β-葡萄糖苷酶工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的優(yōu)良菌株。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

所有用到的化學(xué)藥品均購買于上海生工生物工程公司，秸稈的腐土采集于常年堆積的秸稈堆下方。

1.1.2 工農(nóng)業(yè)廢料

工農(nóng)業(yè)廢渣即麥麩（WB）、氣爆玉米秸稈（TCS）、未處理的玉米秸稈（UTCS）、酒糟（DDG）、玉米漿（CSL）、豆粉（SM）或豆餅粉（BCP）都在當(dāng)?shù)孬@得，將這些原料烘干并進一步粉碎，過0.355 mm（45目）篩備用。

1.1.3 儀器設(shè)備

SKP-01電熱恒溫培養(yǎng)箱、SKPC-01電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：湖北省黃石市醫(yī)療器械廠；VS-1300-U超凈工作臺：蘇凈集團安泰公司；752紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；MDF-492超低溫電冰箱：日本三洋公司；可調(diào)式微量取液器：德國Eppendorf公司等。

1.1.4 培養(yǎng)基

纖維二糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基：每升中含有酵母2.5 g，纖維二糖 2.5 g，蛋白胨 2.5 g，（NH4）2SO4，1 g；KH2PO4，0.5 g和MgSO40.2 g。

篩選培養(yǎng)基：在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入七葉苷水合物1 g；瓊脂粉20 g；滅菌后加入濾菌后的檸檬酸鐵銨溶液至三價鐵終濃度為0.3%[6]。

PDA培養(yǎng)基：用于菌種培養(yǎng)和活化等，加200g土豆的煮出濾汁，葡萄糖20g，加20g瓊脂，補水至1000mL。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基：秸稈粉20 g/L，蛋白胨5 g/L，Mandels營養(yǎng)鹽[7][常量元素液（10×），含有（NH4）2SO43.5 g/L，KH2PO42 g/L，（H2N）2CO 0.3g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，CaCl20.3 g/L；微量元素溶液（1000×）含有 FeSO4·7H2O 5 g/L，MnSO4·H2O 1.6 g/L，ZnSO4·7H2O 1.4 g/L，CoCl22 g/L]。121℃下高壓蒸汽滅菌30 min備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株篩選

篩選方案[8]如下：準(zhǔn)確稱取腐土樣本0.1 g加入已消毒的玻璃珠，用100 mL無菌水溶解，搖床振搖制備樣品懸液，然后加入到纖維二糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基，30℃、150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)5 d。整體離心并做梯度稀釋，取102倍～107倍體積稀釋液涂布到篩選培養(yǎng)基平板，觀察并挑選出幾個周圍帶有較大黑圈且黑圈與菌落直徑比值較大的菌落，每株菌單獨接種于纖維二糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基，30℃搖床人工培養(yǎng)3d后12000r/min、4℃離心10 min，取上清測定β-葡萄糖苷酶活性，選取酶活力高的菌株保存。

1.2.2 誘變過程

篩選得到的菌株→制備孢子懸液→UV誘變→涂布篩選平板初篩→保存菌株→DES誘變→涂布篩選平板初篩→產(chǎn)酶復(fù)篩→獲得高產(chǎn)菌株→PDA斜面保存。

1.2.3 菌種誘變

1.2.3.1 制備孢子懸液

取培養(yǎng)3 d菌的PDA斜面4支～5支，用無菌生理鹽水將孢子洗下，并裝入盛有玻璃珠的小三角燒瓶中，充分振搖30 min；將上述菌液離心（3000 r/min，離心15 min），棄去上清液，將菌體用無菌生理鹽水洗滌2次～3次，最后制成孢子懸液；用顯微鏡直接計數(shù)法計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為108個/mL。

1.2.3.2 紫外誘變[9]

將紫外線燈開關(guān)打開預(yù)熱約20 min，紫外等照射功率為15 W，距離為30 cm。將盛有菌懸液的套平皿置于磁力攪拌器上，紫外線燈下分別攪拌照射30、60、120、180、240、300、360、420、480 和 540 s。取 100 μL 稀釋 10-4、10-5、10-6、10-7的菌液用涂布棒涂布均勻，同時涂布等量稀釋的原孢子懸液做對照，置30℃培養(yǎng)24 h，進行菌落計數(shù)，計算致死率：

1.2.3.3 硫酸二乙酯誘變

使用1.0%DES，于26℃，150 r/min搖床中分別振蕩 20、40、60、80、100、120 和 160 min，進行誘變。加入500 μL 25%硫代硫酸鈉終止反應(yīng)，12000 r/min離心10 min，去上清，取1 mL PBS緩沖液洗滌1次離心，加1 mL磷酸緩沖液重懸沉淀后每管取出100 μL稀釋10倍。取稀釋液100 μL涂平板。30℃倒置培養(yǎng)24 h，數(shù)菌落數(shù)，涂篩選平板篩選。

1.2.4 菌株篩選

將誘變得到的菌株進行初篩和復(fù)篩，初篩的過程采用篩選培養(yǎng)基進行，在30℃倒置培養(yǎng)24 h后選擇透明圈和菌落直徑比較大的保存；復(fù)篩的過程采用纖維二糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，在30℃，120 r/min培養(yǎng)3 d后，10000 g離心10 min，選擇上清測定β-葡萄糖苷酶活力。

1.2.5 測定酶活力[10]

培養(yǎng)結(jié)束后取樣品懸液12000×g離心5 min，留取上清測定酶活力。

β-葡萄糖苷酶活性測定方法：取上清液適當(dāng)稀釋的酶液0.5 mL，加入2 mL 0.5%的水楊素（乙酸鈉緩沖液，pH 0.5，100 mmol/L）37℃反應(yīng) 30 min，加入 2.5 mL DNS后沸水浴5 min，混勻，靜止10 min，540 nm測定吸光度。

一個酶活性單位（U）定義為實驗條件下每分鐘從底物中釋放1 μmol還原糖所消耗的酶的量。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離和鑒定

從腐敗土樣中挑選出幾個在篩選培養(yǎng)基上長出較大黑圈的單菌落。經(jīng)過PDA的劃線培養(yǎng)純化后，得到10株在篩選平板上能夠產(chǎn)生較大透明圈比值的菌株分別命名為（zyb 1、zyb 2、zyb 3、zyb 4、zyb 5、zyb 6、zyb 7、zyb 8、zyb 9 和 zyb 10），將這 10 株菌分別接種在纖維二糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，均表現(xiàn)出良好的生產(chǎn)胞外β-葡萄糖苷酶性能。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長的菌株離心測定上清液中的β-葡萄糖苷酶活力分別為：0.315、0.513、0.419、0.673、0.821、0.801、0.327、0.568、0.596、0.415 U/mL。選取β-葡萄糖苷酶活最高的菌株及zyb 5進行誘變選育。

2.2 誘變結(jié)果

2.2.1 紫外誘變

紫外誘變是一種常用的物理誘變手段。微生物在經(jīng)過紫外線照射后，會受到不同程度的損傷，導(dǎo)致DNA或者是染色體發(fā)生畸形，從而導(dǎo)致生物性狀的改變。在紫外誘變過程中，要了解菌株對紫外線的敏感性，需要進行誘變致死曲線的測定，根據(jù)致死曲線來確定最佳的紫外誘變時間。圖1為紫外誘變過程中隨著照射紫外時間延長得到的致死率曲線。

圖1 紫外誘變致死率曲線Fig.1 Fatality rate after UV mutataion

根據(jù)文獻報道曲線中達到最佳誘變效果的致死率應(yīng)該在70%～80%[11-12]，在此過程中選擇的紫外誘變時間為300 s，此時致死率達到了77%，后面的實驗選擇紫外誘變的時間為300 s。

按照紫外誘變的方案，對得到的zyb 5菌株進行紫外誘變選育，經(jīng)過初篩和復(fù)篩得到5株活力較高的菌株，分別命名為 UV-1，UV-2，UV-3，UV-4和 UV-5。在纖維二糖誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，它們發(fā)酵上清產(chǎn)酶活力分別為：1.21、1.05、1.18、1.38 和 1.25 U/mL。根據(jù)酶活力作為指標(biāo)的篩選結(jié)果，DES誘變的出發(fā)菌株選擇UV-4菌株。

2.2.2 硫酸二乙酯誘變

硫酸二乙酯是常用的化學(xué)誘變劑，主要的原理是導(dǎo)致堿基對的轉(zhuǎn)換、缺失和易位等。本實驗在紫外誘變高產(chǎn)菌株的基礎(chǔ)上，對UV-4菌株的孢子懸液按照不同的處理時間進行處理。得到UV-4菌株在硫酸二乙酯誘變劑存在隨著時間變化的致死率曲線見圖2。

圖2 硫酸二乙酯誘變致死率曲線Fig.2 Fatality rate after DES mutataion

從圖2中可以看出，當(dāng)使用DES處理時間達到100 min后，UV-4菌株的致死率達到了89%，時間延長后致死率太大，得到的菌株很難在進行初篩和復(fù)篩?？紤]到突變較多又容易篩選，所以選擇DES的誘變時間為100 min。按照DES誘變的方案，對得到的UV-4菌株進行誘變選育，經(jīng)過初篩和復(fù)篩得到10株活力較高的菌株，分別命名為UV-4-DES1，UV-4-DES2，UV-4-DES3，UV-4-DES4，UV-4-DES5 和 UV-4-DES6。在纖維二糖誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，它們發(fā)酵上清產(chǎn)酶活力分別為：2.15、2.01、2.21、2.32、2.04、2.35U/mL。根據(jù)酶活力作為指標(biāo)的篩選結(jié)果，DES誘變的出發(fā)菌株選擇UV-4-DES6菌株。

2.3 UV-4-DES6菌株的發(fā)酵生產(chǎn)

纖維素酶尤其是β-葡萄糖苷酶的成本非常昂貴，為了降低生產(chǎn)成本。本研究在篩選誘變高產(chǎn)菌株的基礎(chǔ)上，使用工農(nóng)業(yè)廢料包括麥麩（WB）、氣爆玉米秸稈（TCS）、未處理的玉米秸稈（UTCS）、酒糟（DDG）、玉米漿（CSL）、豆粉（SM）或豆餅粉（BCP）替代誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的纖維二糖，以發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)加入量，將工農(nóng)業(yè)廢料作為UV-4-DES6菌株發(fā)酵的碳源和氮源，30℃，120 r/min發(fā)酵3 d后，離心取上清測定酶活力。其中麥麩(WB)、處理過的玉米秸稈（TCS）、未處理的玉米秸稈（UTCS）和小麥秸稈（WS）被用作碳源，玉米漿（CSL），酒糟（DDG），豆粉（SM）和豆餅粉（BCP）被用作氮源，對誘變菌株的β-葡萄糖苷酶的生產(chǎn)進行培養(yǎng)基活性的選擇。表1記錄了所得結(jié)果，可以看出，在使用工農(nóng)業(yè)廢料作為生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的培養(yǎng)基而言，大部分具有比纖維二糖作為底物時更高的產(chǎn)酶能力。這也說明了誘變的UV-4-DES6菌株同樣具有其它種纖維素酶生產(chǎn)的能力，可以完全降解這些工農(nóng)業(yè)廢料。就提高β-葡萄糖苷酶活性來說，處理過的玉米秸稈（TCS）是最好的碳源。這可歸因于其前處理過程及組成成分。經(jīng)氣爆前處理后0.6%的葡萄糖（TCS）及疏松的結(jié)構(gòu)組成更適合于β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)生。來自不同工農(nóng)業(yè)廢料的氮源對β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生的影響極為顯著。加入豆粉后所得β-葡萄糖苷酶活性為2.738 U/mL，比纖維二糖作為碳源時酶活力增加了0.386 U/mL?？赡苁且驗槎狗郏⊿M）富含微量元素和維生素等物質(zhì)。用工農(nóng)業(yè)廢料作為碳源和氮源生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶不但可以降低產(chǎn)酶的成本，也減少環(huán)境污染。

表1 碳源和氮源對UV-4-DES6菌株所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活性的影響Table 1 Effect of carbon and nitrogen sources on BGL activity of UV-4-DES6

3 結(jié)論

本研究從常年堆積玉米秸稈的腐土中分離得到一株能生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株zyb 5，此菌株具有較強的生長繁殖能力和產(chǎn)酶能力。對zyb 5進行紫外和化學(xué)誘變，得到菌株UV-4-DES6。在30℃，150r/min搖床發(fā)酵4 d后，產(chǎn)酶活力由出發(fā)菌株的0.821 U/mL上升到2.352 U/mL，提高了2.8倍。在此基礎(chǔ)上采用工農(nóng)業(yè)廢料作為生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的培養(yǎng)基，經(jīng)過優(yōu)化β-葡萄糖苷酶活力升高了0.386U/mL，達到了2.738U/mL。與文獻中已報道的其它菌類Monascus purpureus（2.04U/mL）[13],Penicillium echinulatum（0.31U/mL）[14],and Trichoderm-areesei（0.26 U/mL）[15]相比，本菌株的β-葡萄糖苷酶的酶活較高，而且產(chǎn)酶效率高，產(chǎn)酶較快。這種來源于腐土后經(jīng)過誘變的UV-4-DES6菌株具有很強的工業(yè)化應(yīng)用價值。

[1]劉澤寰,唐根云,全艷彩,等.綠色木霉BGLⅠ基因在釀酒酵母中的克隆表達及其纖維素乙醇發(fā)酵[J].蘭州大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2009(3):140-148

[2]江昌俊，李葉云.茶樹鮮葉中β-葡萄糖苷酶的提取條件研究[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2000，23(2)：93-96

[3]朱鳳妹.原生質(zhì)體融合曲霉菌株β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)及對葡萄酒增香調(diào)控作用的研究[D].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文,2008

[4]王革平.多渠道提高粗飼料的利用率[J].畜牧與飼料科學(xué),2006,27(5):23-30

[5]高祥照，馬文奇，馬常寶,等.中國作物秸稈資源利用現(xiàn)狀分析[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2002,21(3):242-247

[6]R M,Wood P J.Use of Congored-polysaccharide interactions inenu-meration and characterization of cellulolytic bacteriafromthe-bovinerumen[J].Appl Environ Microbiol,1982,43:777-780

[7]Mandels M,WeberJ.The production of cellulases.Reese ETCellulases and their sapplication[J].American Society for Microbiology,1996,95:391-413

[8]顧衛(wèi)民,郭海風(fēng),沈愛光.β-葡萄耱苷酶產(chǎn)生茼、發(fā)酵條件的優(yōu)化、粗分離及其特性研究[J].江蘇食品與發(fā)酵,2001(4):12-16

[9]張新峰,張華山,王偉平,等.原生質(zhì)體紫外誘變選育木聚糖酶高產(chǎn)菌株[J].中國釀造,2010(9):73-76

[10]李平,宛曉春,丁霄霖,等.黑曲霉β-葡萄糖苷酶的活力測定和酶學(xué)性質(zhì)[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1998,25(3):304-309

[11]王春麗,武改紅,陳暢,等.黑曲霉原生質(zhì)體誘變選育β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株[J].生物工程學(xué)報,2009,25(12):1921-1926

[12]周海鷗,汪傳高,張益波,等.統(tǒng)計學(xué)分析方法應(yīng)用于桑黃菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].食品研究與開發(fā),2009,30(5):44-48

[13]Daniel J Daroit,Silvana T Silveira,Plinho F Hertz,et al.Production of extracellular β-glucosidase by Monascus purpureus on different growth substrates[J].Process Biochemistry,2007,42:904-908

[14]Leonardo Faria Martins,Daniel Kolling,Marli Camassola,et al.Comparison of Penicillium echinulatum and Trichoderma reesei cel-lulases in relation to their activity against various cellulosic substrates[J].Bioresource technology,2008,99:1417-1424

[15]鄔敏辰,李江華.里氏木霉固體發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的研究[J].江蘇食品與發(fā)酵,1998(2):2-6