結(jié)晶紫-ZnS-BSA光度法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量

胡衛(wèi)平，焦嫚，董學(xué)芝，王鑫

（河南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院環(huán)境與分析科學(xué)研究所，河南 開封 475004）

蛋白質(zhì)是人類生命活動(dòng)中最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)，基本組成單位是氨基酸，組成蛋白質(zhì)的氨基酸有20余種，體內(nèi)只能合成一部分，其余則由食物蛋白質(zhì)供給，準(zhǔn)確測(cè)定蛋白質(zhì)的含量是評(píng)價(jià)一種食品質(zhì)量的重要手段[1]。目前蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法很多，蛋白質(zhì)的測(cè)定方法主要有紫外吸收法[2]、共振瑞利散射法[3]、電感耦合等離子體法[4]、流動(dòng)注射法[5]等。

紫外分光光度法由于操作簡(jiǎn)單、儀器使用方便、測(cè)定速度快等優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用廣泛，目前分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)的研究主要是利用小分子有機(jī)染料與蛋白質(zhì)相結(jié)合的光譜探針?lè)矫妗＝Y(jié)晶紫是一種堿性三苯甲烷類染料，已有文獻(xiàn)報(bào)道，以結(jié)晶紫為顯色劑，與牛血清白蛋白（BSA）作用生成紫紅色配合物，并且吸光度較結(jié)晶紫明顯增大，從而測(cè)定蛋白質(zhì)的含量[6]。

但是利用結(jié)晶紫與ZnS相結(jié)合并用分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量鮮見報(bào)道?；赯nS與結(jié)晶紫作用可使結(jié)晶紫的吸光度降低，加入不同量的蛋白質(zhì)，體系的吸光度逐漸增大，并且與BSA濃度在一定范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。據(jù)此，建立了結(jié)晶紫-ZnS-BSA分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的新方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

牛血清白蛋白（BSA）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；B-R緩沖溶液（取濃度均為0.04 mol/L的硼酸、磷酸、醋酸混合溶液，用0.02 mol/L的NaOH調(diào)至所需pH）；NaH2PO4（0.0175 mol/L）－Na2HPO4（0.0175 mol/L）緩沖溶液（pH=7.00）；巰基乙酸（0.1 mol/L），Zn（Ac）2·2H2O（0.1 mol/L），Na2S（0.1 mol/L），結(jié)晶紫（10-4mol/L），濃氨水。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

Labtech-1000紫外-可見分光光度計(jì)：北京萊伯泰科儀器有限公司；pHS-3CT型酸度計(jì)：上海大普儀器有限公司；CL-4型恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 ZnS量子點(diǎn)的制備

在80mL的燒杯中，依次加入蒸餾水50mL、Zn（Ac）2·2H2O 5 mL、巰基乙酸5 mL，加熱到70℃，用濃氨水溶液調(diào)節(jié)pH到8.35。在磁力攪拌器作用下，緩慢加入Na2S 4 mL，攪拌2 h，得到一定粒徑大小的ZnS納米微粒。

1.3 方法

在10 mL容量瓶中，依次加入0.5 mL結(jié)晶紫溶液、3.5 mL NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液、2 mL ZnS 溶液、含適量BSA的溶液，蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。于30℃溫度下反應(yīng) 15 min，在最大吸收波長(zhǎng)（λmax）590 nm處進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 體系的吸收光譜

體系的吸收光譜示于圖1。

圖1 紫外吸收光譜Fig.1 UV absorption spectrum

可以看出BSA與ZnS在可見光區(qū)無(wú)吸收，結(jié)晶紫在590 nm處有最大吸收，加入ZnS溶液反應(yīng)后使結(jié)晶紫吸光度降低，隨著不同量BSA溶液的加入，體系的吸光度逐漸增大。

2.2 酸度對(duì)體系吸光度的影響

配制一系列不同pH的B-R緩沖溶液，按照試驗(yàn)方法，測(cè)定不同酸度下的吸光度A，以A對(duì)不同酸度（pH）作圖（見圖2）。

圖2 酸度的影響Fig.2 Effect of Acidity

試驗(yàn)表明，隨著pH的增大，A逐漸降低，但當(dāng)體系的酸度（pH）在6.0～8.0范圍內(nèi)，體系A(chǔ)趨于穩(wěn)定，試驗(yàn)選擇pH為7.0的緩沖溶液。

試驗(yàn)對(duì) Na2HPO4·12H2O-NaH2PO4、Na2HPO4-檸檬酸、檸檬酸-檸檬酸鈉、NaH2PO4-NaOH及B-R緩沖溶液進(jìn)行選擇，表明pH為7.0的Na2HPO4·12H2O-NaH2PO4緩沖溶液使體系的吸光度增加顯著。

進(jìn)一步對(duì)緩沖溶液的用量進(jìn)行選擇，見圖3。

圖3 緩沖溶液用量的影響Fig.3 Effect of the volume of buffer

試驗(yàn)表明，隨著緩沖溶液用量的增加，A逐漸增大，在3.5 mL時(shí)體系吸光度達(dá)到最大。試驗(yàn)選擇pH7.0的 Na2HPO4·12H2O-NaH2PO4緩沖溶液 3.5 mL。

2.3 結(jié)晶紫的用量對(duì)體系吸光度的影響

按照試驗(yàn)方法，固定其他條件不變，取不同體積的結(jié)晶紫溶液（10-4mol/L），并測(cè)定體系的吸光度，見圖4。

圖4 結(jié)晶紫溶液用量的影響Fig.4 Effect of the volume of methyl violet

試驗(yàn)表明，隨著結(jié)晶紫用量的增加，吸光度逐漸增大，在0.5 mL后吸光度增加緩慢，因此選擇10-4mol/L的結(jié)晶紫溶液0.5 mL。

2.4 ZnS的用量對(duì)體系吸光度的影響

固定其他條件不變，改變ZnS的用量，測(cè)定體系的吸光度，以吸光度A對(duì)ZnS的用量作圖，見圖5。

試驗(yàn)表明，隨著ZnS用量的增多，體系的吸光度逐漸降低，當(dāng)用量達(dá)到2.0 mL～3.0 mL時(shí)，體系吸光度趨于穩(wěn)定。選擇ZnS溶液用量為2.0 mL。

圖5 ZnS用量的影響Fig.5 Effect of the volume of ZnS

2.5 反應(yīng)溫度和時(shí)間的影響

用溫度控制儀調(diào)節(jié)水溫，在20℃～70℃溫度范圍內(nèi)分別測(cè)定溫度對(duì)體系吸光度的影響，結(jié)果表明，20℃～40℃體系較為穩(wěn)定，隨著溫度的升高，體系的吸光度逐漸升高，試驗(yàn)選擇溫度為30℃。

在30℃的溫度下，測(cè)定反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系的影響，見圖6。

圖6 時(shí)間的影響Fig.6 Effect of the reaction time

試驗(yàn)表明，隨反應(yīng)時(shí)間的增加，體系的吸光度逐漸升高，而反應(yīng)20 min后，吸光度增加緩慢，因此選定反應(yīng)時(shí)間為20 min。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照試驗(yàn)方法，加入不同量的BSA，測(cè)定體系的吸光度，以吸光度A對(duì)BSA濃度C作圖，見7所示。

試驗(yàn)表明，A與BSA濃度在0.0100mg/mL～4.400mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為A=2.0406+0.46050 C（mg/mL），相關(guān)系數(shù)R=0.9962，檢出限為0.009152 mg/mL。

2.7 共存離子的干擾

考察了常見的金屬離子及多種氨基酸對(duì)含有5μg/mL BSA體系的影響，結(jié)果表明，在±5%誤差允許范圍內(nèi)，100倍的檸檬酸三鈉、淀粉、甘氨酸、蔗糖、葡萄糖、尿素、安賽蜜、三聚氰胺，50倍的L-谷氨酸，DL-蘋果酸、NaCl、NH4Cl、KCl，25 倍的 FeCl3、FeSO4、AlCl3，同倍的 BaCl2、Mg（NO3）2、Pb（NO3）2對(duì)試驗(yàn)均沒(méi)有影響。

圖7 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 The calibration curve

2.8 樣品測(cè)定及與標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)照

取肉松 6.5160 g、牛奶 1.9949 g、雞精 5.0050 g，分別稀釋定容至100 mL，振蕩5 h，使樣品中蛋白質(zhì)充分溶解。再取少量乙醚萃取3次除去樣品中的脂肪，棄去溶有脂肪的乙醚層，過(guò)濾，濾液即為待測(cè)液。按照試驗(yàn)方法，測(cè)定樣品中BSA的含量，且與考馬斯亮藍(lán)法做對(duì)照，結(jié)果見表1。

2.9 加標(biāo)回收試驗(yàn)

吸取一定量的樣品測(cè)試液，分別加入一定量的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照實(shí)驗(yàn)方法做加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見表2，可以看出樣品平均回收率較好，說(shuō)明該方法較準(zhǔn)確。

表1 樣品中BSA的測(cè)定結(jié)果Table1 Determination results of BSA samples

表2 加標(biāo)回收試驗(yàn)Table 2 Recovery test

3 結(jié)論

利用ZnS與結(jié)晶紫作用，生成復(fù)合物，該復(fù)合物與蛋白質(zhì)作用，使體系吸光度顯著增大，采用分光光度法法測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的含量。該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速、線性范圍寬，通過(guò)測(cè)定樣品并與標(biāo)準(zhǔn)方法做對(duì)照，結(jié)果滿意，可用于食品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

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