豬肝超氧化物歧化酶的分離純化與初步表征

肖厚榮，楊紅，王中風(fēng)，翟偉華

（合肥學(xué)院生物與環(huán)境工程系，安徽 合肥 230022）

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD，EC 1.15.1.1）是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的金屬酶，由Mann和Keilin于1938年首次從牛紅細(xì)胞中分離得到，為一種藍(lán)色含銅蛋白質(zhì)。1969年McCord和Fridovich發(fā)現(xiàn)該蛋白具有催化O2-·發(fā)生歧化反應(yīng)的功能，故將此酶命名為超氧化物歧化酶[1]。其主要作用是清除超氧陰離子自由基（O2－·）[2]，是一種具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗輻射和消炎作用的藥用酶[3]，在食品、醫(yī)藥、保健品、化妝品等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[4-7]。

動(dòng)物SOD研究主要集中在肝臟和血液，植物SOD則主要集中在仙人掌和煙草等。目前，已建立了從動(dòng)物血紅細(xì)胞中分離純化SOD的多種方法[8-10]，然而，從動(dòng)物肝臟中提取SOD的技術(shù)尚在探討中。本試驗(yàn)以豬肝為原料提取SOD，并對(duì)工藝技術(shù)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，參考有關(guān)文獻(xiàn)[11-14]，運(yùn)用多重線性回歸的方法研究多個(gè)自變量與蛋白的比活力是否存在某種線性關(guān)系或非線性關(guān)系，建立多重回歸方程；同時(shí)對(duì)純化獲得的SOD進(jìn)行了初步表征。

1 材料與方法

1.1 材料

豬肝：購(gòu)自安徽省合肥市黃山路菜市場(chǎng)。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉：天津市化學(xué)試劑三廠；磷酸氫二鉀：上海恒信化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀：廣東西隴化工廠；鹽酸：上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司；鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷：Tris，BR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；十二烷基磺酸鈉（SDS）：上海生化所申華生化公司，以上試劑均為分析純。

1.2.2 儀器

JJ-2組織搗碎勻漿機(jī)：常州國(guó)華電器有限公司；電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；20000轉(zhuǎn)式離心機(jī)：德國(guó)進(jìn)口；BSZ-160型自動(dòng)部分收集器、HL-Z恒流泵：上海瀘西分析儀器廠；Z型系列層析柱：上海錦華實(shí)驗(yàn)器械廠；Libra S22型紫外分光光度計(jì)：英國(guó) Biochrom；Agilent1100液相色譜系統(tǒng)：Agilent,USA；Aeomscan Advantage電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜儀（ICP-AES）：Thermo Jarrell Ash Corporation,USA。

1.3 方法

1.3.1 SOD的酶活力及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

1.3.1.1 測(cè)定酶活時(shí)鄰苯三酚用量的確定

在10 mL試管中加入4.50 mL Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液（50 mmol/L，pH 8.3），在（25±0.5）℃的恒溫水浴中保溫10 min，然后加入50 mmol/L鄰苯三酚溶液（25±0.5）℃（空白管用10mmol/LHCl代替），迅速搖勻倒入1 cm比色皿中，以空白管為參比，在325 nm下，每隔30s測(cè)1次吸光度值，連續(xù)記錄3min。調(diào)節(jié)鄰苯三酚溶液用量，將其自氧化速率控制在0.070（±0.002）D/min，此值即為測(cè)酶活時(shí)鄰苯三酚溶液的用量。

1.3.1.2 SOD酶活力的測(cè)定

酶活力單位定義：在25℃恒溫條件下，每毫升反應(yīng)液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化率達(dá)50%的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。

如上步驟，加入鄰苯三酚溶液（25±0.5）℃9 μL（空白管用10 mmol/L HCl代替），迅速搖勻倒入1 cm比色杯中，以空白管為參比，在325 nm下，每隔30 s測(cè)1次吸光值，連續(xù)記錄3min，調(diào)節(jié)樣液體積，使樣液中連苯三酚的氧化速度控制在0.035（±0.002）D/min，并記錄樣液體積。

其中：A1為自氧化速率；A2為樣液氧化速率；V總為反應(yīng)液總體積；N為樣液稀釋倍數(shù)；V樣為樣液體積。

1.3.1.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用紫外分光光度計(jì)法。

1.3.2 超氧化物歧化酶的提取與分離純化

豬肝500 g，加入500 mL 1.2%KCl溶液后勻漿，離心15 min（10000 r/min），其上清液水浴升溫至一定溫度并保持固定時(shí)間，冷卻，離心20 min（11000 r/min），棄去沉淀；在4℃下向上清液中加入冷丙酮，放置過夜；離心30min（13000r/min，4℃），棄上清液，沉淀即為SOD。

在對(duì)熱變性時(shí)間、熱變性溫度、丙酮用量和提取的鹽濃度等單因素進(jìn)行探討的基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計(jì)方法以酶的比活力為指標(biāo)對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

粗提獲得的SOD經(jīng)Sephadex G-200進(jìn)一步純化。層析柱規(guī)格為Ф26×100（mm），洗脫液為0.05 mol/L NaCl，流速為 12 mL/h，每管收集 4 mL。

1.3.3 超氧化物歧化酶的檢測(cè)與表征

1.3.3.1 SOD純度及分子量測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)和純化得到的SOD在同一條件下進(jìn)行SDS-PAGE，根據(jù)相對(duì)遷移率可直接在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出分子量，同時(shí)可以獲得蛋白質(zhì)純度信息。

為進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白質(zhì)是否達(dá)到單一組分的純度，使用高效液相色譜對(duì)純化得到的SOD進(jìn)行檢測(cè)。色譜條件：Zorbax SB-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm，Agilent，USA）；流動(dòng)相：pH 8.30 的 50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液（超純水配制）；流速:1.0 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm，280 nm；柱溫:30℃；進(jìn)樣量：500 μL。

1.3.3.2 紫外-可見光譜與電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜

1）紫外-可見光譜

純SOD粉末溶于去離子水，在190 nm～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，測(cè)定它的最大吸收波長(zhǎng)。

2）金屬離子測(cè)定及類別鑒定

在1.8 mg純SOD（預(yù)先在50℃條件下干燥24 h）中加入10 mL 0.02 mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 7.0），所得酶液裝入透析帶（半透膜）在去離子水中透析至電導(dǎo)不再變化。處理后的樣品用電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜儀測(cè)金屬離子的種類和含量。

1.3.3.3 SOD的酶學(xué)性質(zhì)

以鄰苯三酚為底物，改變反應(yīng)體系緩沖液的溫度、pH，分別測(cè)定SOD的最佳反應(yīng)溫度和最佳pH，并通過雙倒數(shù)法測(cè)定該酶的Km值和Vmax。

2 結(jié)果與討論

2.1 超氧化物歧化酶的提取與分離純化

2.1.1 超氧化物歧化酶提取條件的優(yōu)化

在前期單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用L9（34）設(shè)計(jì)來優(yōu)化酶的提取與分類純化條件，以SOD的比活力為衡量標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 正交試驗(yàn)表Table 1 Orthogonal test

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表2所示。

表2 方差分析表Table 2 Tests of Between-Subjects Effects

以上方差分析表明4個(gè)因素的P值均小于0.001，差異極顯著，故對(duì)試驗(yàn)中的A、B、C、D四因素采用SN-K法進(jìn)行多重比較，誤差均方=167.1，調(diào)和樣本容量=6.0,α=0.05，結(jié)果見表1所示。

由表1多重比較和極差R可知：因素的影響大小依次為：A>C>D>B。A因素的3個(gè)不同水平間差異均顯著。試驗(yàn)中觀察到，當(dāng)熱變性溫度為50℃和60℃的時(shí)候，所沉淀的雜蛋白明顯少于70℃時(shí)的量。而酶活測(cè)定則表明，熱變性溫度為70℃所得SOD的比活力及總活力均高于其他兩組。故本試驗(yàn)中，SOD提取的熱變性溫度為70℃。

B因素為20 min的這一組與其他兩組相比，差異顯著；而熱變性時(shí)間為10 min和30 min的這兩組間，差異不顯著。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SOD酶比活力隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)；30 min組的比活力雖大于10 min的組，但這兩組從統(tǒng)計(jì)學(xué)上檢驗(yàn)差異不顯著，故從節(jié)能的角度考慮，選擇熱變性時(shí)間為10 min。

C因素為1.4和1.8這兩組相比，差異不顯著，但這兩組與1.6倍體積的相比，差異均顯著，且1.6組所得的SOD的比活力比其他兩組均大。

丙酮用量對(duì)SOD的比活力的影響較大，SOD的比活力隨著丙酮用量的增大，剛開始出現(xiàn)增加的趨勢(shì)，但當(dāng)丙酮用量超過1.6倍體積時(shí)，SOD的比活力卻出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。從生物統(tǒng)計(jì)角度來講，丙酮用量為1.6倍體積的這一組與其他兩組結(jié)果差異顯著。綜合考慮節(jié)約成本和所得產(chǎn)品比活力，本實(shí)驗(yàn)丙酮用量為1.6倍體積。

D因素為1%，1.2%和1.4%這三組相比，差異均顯著。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鹽濃度為1.4%的時(shí)候，所得到的SOD的比活力高于其他兩組。同時(shí)，從統(tǒng)計(jì)學(xué)的角度來說，鹽濃度為1.4%的這一組與其他兩組結(jié)果差異顯著。所以，在本試驗(yàn)的范圍內(nèi)，SOD提取的最佳鹽濃度為1.4%。

故本試驗(yàn)方案的最佳組合為A3B1C2D3。即：熱變性溫度為70℃，熱變性時(shí)間為10 min，丙酮用量為1.6倍體積，鹽濃度為1.4%。

2.1.2 SOD的純化、純度鑒定與分子量測(cè)定

2.1.2.1 SOD的純化

粗提獲得的SOD經(jīng)Sephadex G-200柱層析純化，其收集液逐管測(cè)定酶活和波長(zhǎng)280 nm處吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、以管數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，結(jié)果見圖1。

圖1顯示，共有4個(gè)蛋白峰。酶活測(cè)定結(jié)果顯示，第3個(gè)峰顯示SOD酶活性。

2.1.2.2 SOD中金屬離子種類與含量

紫外-可見光譜結(jié)果顯示豬肝SOD的紫外最大吸收波長(zhǎng)為255nm（見圖2），而不是一般蛋白的280 nm，這表明該酶為Cu，Zn-SOD，因?yàn)镃u，Zn-SOD的明顯特征為最大紫外吸收在250 nm～270 nm，與文獻(xiàn)報(bào)道的茶葉、鴨血中的Cu，Zn-SOD最大紫外吸收波長(zhǎng)在265.4 nm和258 nm相符。

圖1 Sephadex G-200色譜分離Fig.1 Chromatography of Sephadex G-200

圖2 SOD紫外吸收光譜Fig.2 UV Spectra of the purified SOD from liver

ICP-MS分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，分離純化得到的SOD含銅鋅元素，且銅離子、鋅離子、蛋白質(zhì)分子的比例為 1∶1∶1。

2.1.2.3 SOD分子量的測(cè)定

圖3 Cu，Zn-SOD的SDS-PAGE電泳Fig.3 SDS-PAGE of Cu,Zn-SOD from liver

純化的樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳、染色后為一條電泳帶，說明純化后的SOD酶為均一蛋白質(zhì)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果作對(duì)數(shù)分子量相對(duì)遷移率曲線，計(jì)算得該Cu，Zn-SOD酶的對(duì)數(shù)分子量為32 ku，而Cu，Zn-SOD酶是由2個(gè)相同亞基組成[15-16]，單一條帶的分子量約為16 ku。這一試驗(yàn)結(jié)果與蘇昕[16]等報(bào)道酵母SOD結(jié)果相吻合。

純化得到的SOD液相色譜檢測(cè)結(jié)果見圖4。

圖4 SOD的HPLC譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of SOD from liver

由圖4可見，SOD的HPLC譜圖出現(xiàn)了單一的對(duì)稱峰，圖中橫坐標(biāo)為流動(dòng)相的體積，流動(dòng)相的流速為1 mL/min?？梢钥闯觯撁傅募兌容^高。由此可見，HPLC與SDS-PAGE的結(jié)果是吻合的。

2.2 SOD的酶學(xué)和理化性質(zhì)

2.2.1 溫度對(duì)SOD活力的影響

溫度對(duì)SOD酶活性的影響見圖5。

圖5 溫度對(duì)SOD活力的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity of SOD

由圖5可以看出，30℃以下時(shí)，SOD的活力隨溫度的升高而增高，30℃時(shí)，SOD的活力最高，當(dāng)溫度超過30℃后，SOD的活力隨著溫度的升高迅速下降，降幅較大（p＜0.01）。相關(guān)學(xué)者[17]從煙草中分離純化得到SOD的3種同功酶，其中Cu-Zn-SODⅠ的最適溫度為30℃，Cu-Zn-SODⅢ的最適溫度約為40℃。

2.2.2 pH對(duì)SOD活力的影響

圖6 pH對(duì)SOD活力的影響Fig.6 Effect of pH on the activity of SOD

pH對(duì)SOD活力的影響見圖6?？梢钥闯?，pH對(duì)SOD活性的影響較大，pH7.3以下時(shí)，SOD活力較低，隨著pH的升高，SOD活力逐漸增高，且增幅較大，pH7.3時(shí)活力最高；當(dāng)pH超過7.3后，SOD活力隨著pH的升高又迅速降低。在pH 6.5～9.0的范圍內(nèi)，SOD具有較高的活力，表明SOD的最適pH范圍是pH 6.5～9.0。劉劍利[18]等報(bào)道利用金屬螯合親和層析法純化的玉米SOD的pH穩(wěn)定范圍是pH6～10之間，與本研究結(jié)果相吻合。

2.2.3 SOD Km值和Vmax的測(cè)定

圖7 雙倒數(shù)作圖曲線Fig.7 Lineweaver-Burk

使用雙倒數(shù)作圖法，以1/[S]為橫坐標(biāo)，1/△A325為縱坐標(biāo)使用Origin進(jìn)行作圖，得到一條直線，直線與X軸的截距為1/Km，與Y軸的截距為1/Vmax，從而得到Km=1.574、Vmax=0.268。

3 結(jié)論

1）以豬肝為原料，通過抽提液加熱、丙酮沉淀和Sephadex G-200層析柱色譜提取、純化，可以得到單一組分的 Cu，Zn-SOD。

2）最佳的提取條件是：在1.4%的鹽濃度下，于70℃水浴中熱變性10 min，然后加1.6倍體積的丙酮獲得SOD粗沉淀。

3）紫外-可見吸收光譜和ICP-MS分析結(jié)果均表明得到的是含銅、鋅的SOD，即Cu，Zn-SOD，且銅離子、鋅離子、蛋白質(zhì)分子的比例為 1∶1∶1。

4）豬血Cu，Zn-SOD分子量為32 ku，由2個(gè)相同亞基組成，單一條帶的分子量約為16 ku。

5）豬血 Cu，Zn-SOD 最適為 pH7.3，最適溫度為30℃。

6）以鄰苯三酚為底物，該酶的Km值為1.574，Vmax為0.268。

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