一氧化氮對果蔬保鮮機理的探索進展

周春麗，呂玲琴，蘇虎，李玉萍

（江西科技師范學院生命科學學院，江西 南昌 330013）

長期以來，人們只知道NO是一種環(huán)境污染物,污染空氣，形成酸雨，破壞臭氧層,對人類的危害引起全球的關注。而在生物活性分子一氧化氮于1987年被Palmer等用化學發(fā)光方法證實其本質是NO[1-2]后。NO受到人們高度重視，成為研究的熱點。1992年被Science評為“年度明星分子”[3]。而在1998年，F(xiàn)urchgott、Ignarro和Murad也對NO作了相應的研究，并獲得了當年的諾貝爾生理學和醫(yī)學獎。NO也是植物體中普遍存在的關鍵信號分子，參與植物細胞的多種生理過程。其在園藝產(chǎn)品保鮮作用也陸續(xù)展開研究。如：Leshem和Wills[4]首次報道NO對草莓果實成熟和衰老影響和控制作用，NO與植物細胞中的脂氧合酶[5]、漆酶[6]、過氧化氫酶[7]、抗壞血酸氧化酶[8]的反應，從而影響植物細胞的成熟與衰老。

截止到2010年，氣調保鮮仍然是蔬菜保鮮的主要方式，NO用于氣調保鮮是近年來農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮的一個研究熱點，近來，有學者用SNP（硝普鈉）研究了對蒜苔和馬鈴薯保鮮效果的影響[9-10]，并觀察其保鮮效果。但NO對果蔬類具體的作用機理，迄今還少有更系統(tǒng)、更完整的研究。本文將從以下幾個方面概述NO對果蔬的作用機理及其研究展望。

1 NO的物理化學特性

1.1 NO的物理特性

一氧化氮是氮氧化合物，化學式NO，分子量30，氮的化合價為+2。無色氣體，難溶于水。能助燃，有毒，具刺激性。根據(jù)共振理論，NO有以下幾種共振形式[11]：

圖1 NO的幾種共振形式Fig.1 Several resonance form in nitric oxide

NO有一個處于2p-Ⅱ反鍵軌道的單電子，是一個自由基，得到一個電子，生成NO-；失去一個電子生成了一氧化氮正離子NO+。在標準條件下（在水中，25℃，101 kPa），它的熔點為163.6℃，沸點為151.8℃，溶解度為1.8×103mol/dm3。其他一些物理化學性質見表1[12]。

表1 一氧化氮的物理化學性質Table 1 Physichemical property of NO

1.2 NO的化學特性

NO具有強氧化性。與易燃物、有機物接觸易著火燃燒。遇到氫氣爆炸性化合。接觸空氣會散發(fā)出棕色有氧化性的煙霧。一氧化氮較不活潑，但在空氣中易被氧化成二氧化氮或是三氧化二氮[13]。水溶液中NO的自養(yǎng)化是非常復雜的過程，存在兩個可能的機制[14]。在機制I中ONOO是反應產(chǎn)生的第一個中間產(chǎn)物，接著連續(xù)發(fā)生 四 步 化 學 反 應 分 別 生 成 ONOONO、NO2、N2O3和2NO2-。機制II是從NO的二聚化反應開始生成N2O2，接著加氧反應生成N2O4，N2O4轉變?yōu)閮煞肿覰O2，NO2繼續(xù)和NO發(fā)生反應生成N2O3，N2O3發(fā)生水解生成NO2-。但是水溶液中NO與O2的總反應式與氣相中N2O3溶于水后的總反應式相同。NO與O2-反應生成ONOO-，其質子化產(chǎn)物為化學活性很強的過氧亞硝（ONOOH）。后者可與甲硫氨酸或巰甲基化合物反應產(chǎn)生NO2、OH-、乙烯等[15]。

2 植物體內一氧化氮的來源

2.1 內源NO的來源

2000年以后，很多實驗已經(jīng)在油菜、菠菜、玉米、甘蔗煙草等多種植物內中檢測到NO的存在。表明植物體內至少存在3條形成NO的途徑，包括一氧化氮酶（NOS）合成NO；硝酸還原酶或亞硝酸還原酶（NR/NiR）形成NO；以及非酶途徑形成NO。具體形成的方式和步驟如圖2[16]。

圖2 內源NO的來源Fig.2 The origin of nitric oxide invegetables and fruits

2.1.1 一氧化氮酶合成NO

現(xiàn)今，對動物的NOS已經(jīng)有了比較明確的認識，認為動物細胞中有神經(jīng)NOS（nNOS）、內皮細胞NOS（eNOS）和可誘導的NOS（iNOS）等3種NOS[17]。在哺乳動物中，NO是由L-精氨酸、NADPH和氧分子通過NOS催化形成的，該反應需要輔因子四氫生物素喋呤，反應的終產(chǎn)物為L-瓜氨酸、NO和NADP+。自從在豆科植物中檢測到類似哺乳動物類型的NOS以來，植物NOS的研究取得顯著進展，先后在煙草、大豆、小麥、玉米和紫杉等植物中也發(fā)現(xiàn)了類似NOS的活性存在，這種活性受到動物NOS抑制劑的抑制。目前，人們已經(jīng)對植物中NOS的編碼基因、cDNA序列以及與動物NOS高度同源的蛋白的分離等方面展開研究。最近，煙草NOS被成功地分離鑒定，認為它是甘氨酸羧酶P蛋白的一種變體形式。這是在植物中第一次發(fā)現(xiàn)與哺乳動物NOS相似的酶[18]。今后更多植物內源NOS的分離鑒定及其編碼基因的確認將會為植物NOS的存在和NO產(chǎn)生機制提供充分的證據(jù)。

2.1.2 硝酸還原酶合成一氧化氮

通過實驗，已經(jīng)在原核生物中發(fā)現(xiàn)3種不同的NR家族[19]，即NASI、NAR和NAP。其中NASI位于胞質區(qū)域[20]。而高等植物中的NR/NiR是氮代謝的關鍵酶。NR/NiR催化硝酸鹽或亞硝酸鹽和NADH或NADPH形成NO[21]，具體如圖3，目前已經(jīng)在向日葵、菠菜等中發(fā)現(xiàn)NR催化形成NO[21-22]，而硝酸還原酶催化產(chǎn)生NO的研究已經(jīng)在完整的植株如大豆、太陽花葉片、菠菜葉片等廣泛開展。

圖3 植物體內由NR催化形成NO的途徑[23]Fig.3 The path of formation nitric oxide by nitrate reductase catalysis in plants

2.1.3 非酶促途徑

非酶促反應產(chǎn)生NO在植物組織中占有重要地位。大多數(shù)情況下，在酸化的區(qū)域或組織中NO多經(jīng)非酶途徑形成[22]。NO可以經(jīng)由反硝化作用和生物固氮形成，硝化作用和反硝化作用將N2O氧化形成NO，由類胡蘿卜素轉化的光介導非酶反應產(chǎn)生NO，抗壞血酸或光參與時由NO2形成NO，NO也是植物呼吸作用的副產(chǎn)品，植物甚至可以感知土壤微生物產(chǎn)生NO。NO還可在外界脅迫條件下如除草劑處理后產(chǎn)生，受脅迫的植物細胞中伴隨氧爆（oxidative burst）也可以迅速產(chǎn)生NO[17]。

一般來說，有氧條件下以來NR的途徑是形成NO的主要方式，酸化區(qū)域或組織則多是非酶途徑形成NO[22]。

2.2 外源NO的來源[13]

一些化學反應可以得到NO

銅和稀硝酸反應 3Cu+8HNO3=3Cu（NO3）2＋2NO＋4H2O

二氧化氮通到水中H2O+3NO2=NO+2HNO3

在空氣中高壓放電N2+O2=2NO

再比如KI、硫酸與KNO2三者混合反應（KNO2與NO之間的比例為1∶1）

2KNO2+2KI+2H2SO4→2NO+I2+2H2O+2K2SO4

亞硝酸和抗壞血酸（ascorbic acid ASA）等在酸性條件下反應也可以產(chǎn)生一氧化氮。其方程式如下：

此外，可以從釋放NO的載體化合物中獲得，比如硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）和S-亞硝基-N-乙酰基霉（S－nitroso－N－acetyl－pennicillamine，SNAP）。

3 NO對果蔬的作用機理

目前NO延長綠色蔬菜保鮮保鮮期的研究主要集中在2個方面，一方面是NO的最佳處理條件，如濃度、時間等因素的研究；另一方面是NO的釋放研究。關于NO延長果蔬保存期的機理也主要存在2個途徑，一方面認為NO處理抑制了果蔬內源乙烯的合成，從而延緩其成熟，達到延長保鮮的效果[24]；另一方面認為NO處理使得果蔬抗氧化酶系，如超氧化物歧酶（Super oxide dismasts，SOD），過氧化物酶（Peroxidase，POD）等活性增強，提高了抗氧化能力，從而達到延長保鮮期的效果[25]。

3.1 NO抑制內源乙烯的形成

乙烯在果實成熟過程中起著重要的調節(jié)作用，這種作用是通過乙烯生成量的增加和組織對乙烯敏感性的改變而實現(xiàn)的。

ACO也是植物衰老過程中乙烯生物合成的一個關鍵酶。近年來研究發(fā)現(xiàn)，NO作為一種生物活性小分子，可以有效的抑制植物組織中ACS和ACO的活性[24-27]，見圖4，從而顯著抑制了乙烯的生物合成。從而延緩綠色蔬菜的衰老。

圖4 NO和過氧化硝酸的乙烯合成調控模型Fig.4 Proposed mode of NO and peroxynit rite down regulation of ethylence

植物體內乙烯受體是乙烯生物合成和信號轉導途徑中的一個關鍵信號因子，可以感知乙烯的作用，并誘導ACO基因的表達，表現(xiàn)為外源乙烯處理后蔬果的ACO活性迅速升高和乙烯生成量的增加。NO還可以通過調控ACC合成酶及ACC氧化酶而抑制乙烯的合成[28]。Leshem和Haramaty[29]用KNO3等反應產(chǎn)生的NO熏蒸豌豆葉片，并在部分處理的溶液中加入乙烯前體物質ACC，2 h后發(fā)現(xiàn)無論施用ACC與否，NO與乙烯均同時釋放，在未以ACC處理的實驗中，乙烯和NO釋放均下降，但NO釋放量多于乙烯。低濃度NO促進豌豆葉片的伸展，高濃度則有使其縮小的趨勢，將葉片直接置于純NO中時出現(xiàn)明顯生長下降趨勢。于此，可以推斷出，乙烯濃度的變化對蔬果成熟與衰老有很大的影響。

Leshem等[30]采用N－叔丁基－α－苯基硝酮（PBN）和3－嗎啉－斯德酮亞胺（3－morpholinosydnonimine，SIN－1）等所釋放的一定濃度的外源NO來處理鱷梨、香蕉、櫻桃、番茄、獼猴桃、柿和甜橙后，發(fā)現(xiàn)未成熟果實產(chǎn)生的內源NO量均顯著高于成熟的果實，鱷梨和香蕉的未成熟組織中NO含量分別是其成熟果實的約10倍和4倍，證明外源NO均可延遲其成熟衰老。外源乙烯可以促進內源乙烯的生成，而NO可以抑制外源乙烯對內源乙烯的作用，從而達到抑制綠色蔬菜成熟與衰老。2007年，劉孟臣等證實了NO顯著抑制了果實內源乙烯的生物合成，并且NO處理可以顯著抑制外源乙烯所引起的果實中乙烯的生物合成[31]。2009年劉國華等，已經(jīng)驗證了NO可能作為H2O2、Ca2+對介導信號來誘導氣孔的關閉，調節(jié)乙烯的濃度，從而延緩蔬果的衰老，達到保鮮效果[32-33]。具體蔬果內的NO是怎樣起作用的，見圖5。

圖5 植物體內NO作用途徑Fig.5 The path nitric oxide action in plants

圖5是參照Leshem[34]和張文利[35]，并略有改動。ACC：1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸，ACO：順烏頭酸酶，ACS：ACC合成酶，ADPRC：ADP-核糖環(huán)化酶，Ap：抗壞血酸過氧化物酶，cADPR：環(huán)式ADP-核糖，CAR：類胡蘿卜素，CAT：過氧化氫酶，CHS：苯基苯乙烯酮合成酶，COX：細胞色素氧化酶，F(xiàn)R：自由基，cGC：鳥苷酸環(huán)化酶，GST：谷胱苷肽硫轉移酶，IRP：鐵調節(jié)蛋白，NOS：-氧化氮合酶，NR：硝酸還原酶，PAL：苯丙氨酸解氨酶。PR.1：病程相關蛋白-1，SA：水楊酸，SAM：S一腺苷甲硫氨酸，SIPK：水楊酸誘導蛋白激酶，cGMP：環(huán)鳥苷單磷酸，（＋）：促進作用，（-）：抑制作用，（…）：尚需確定的步驟。

3.2 NO與自由基和各酶對延緩蔬果的成熟與衰老的機理

衰老自由基學說認為，自由基產(chǎn)生與清除的平衡對維持生物體正常物質代謝起作用，衰老是自由基過度氧化的過程，任何降低自由基過度氧化的措施都可以延緩衰老。NO可能通過調節(jié)植物體內抗氧化酶的活性調節(jié)ROS含量。已有研究表明NO可通過影響植物體內的抗氧化酶體系影響活性氧含量，從而調控植物體的衰老進程。

NO對生物體有雙重作用。一方面，低濃度NO能迅速清除超氧陰離子（O2－）和脂質自由基（R－），阻斷包括脂質過氧化在內的ROS參與的各種傷害反應，誘導抗氧化酶基因的表達，起保護作用[36-37]。另一方面，高濃度NO與O2-相互作用生成大量的過氧亞硝酸陰離子（ONOO-），后者質子化形成強氧化性的過氧亞硝酸ONOOH，破壞生物大分子的結構與功能，最終具有生物毒性[36]。Lurie S等研究表明，蔬果在采收后H2O2的活性氧代謝加強，對細胞產(chǎn)生毒害，導致細胞膜結構的破壞，從而使果實軟化衰老加快[38]。H2O2可氧化金屬形成高價金屬氧代物等強氧化劑，引起膜脂過氧化造成細胞損傷[39]。H2O2可能通過兩個途徑來減緩這種傷害：一方面，SNP釋放的H2O2既能直接與生物分子發(fā)生相互作用，又能與超氧化物或氧反應生成氮氧化合物（RONS）來間接地發(fā)生硝化作用和氧化作用等[40]，使采后草莓果實維持較高的CAT活性，通過增強CAT活性來消除H2O2引起的膜功能和結構的破壞，使之能更好地維持細胞內膜系統(tǒng)的區(qū)域化作用和膜結構的完整。另一方面，植物組織膜脂過氧化作用的啟動需要LOX[41]，SNP處理明顯地抑制了LOX酶活性，其原因可能是NO與在LOX活性位點上的非血紅素離子發(fā)生化學反應，把這種高價化合物還原到低價狀態(tài)，改變了LOX酶的部分立體結構[42]，導致LOX酶的活性降低，延遲脂質過氧化作用的啟動，保護膜結構的完整，延緩果實軟化。2005年朱樹華等在NO對草莓果實衰老的影響中，證明了NO可以抑制纖維素酶和LOX活性，提高CAT活性，表現(xiàn)出延緩草莓果實軟化衰老的生理作用[7]。2009年，朱先波等用NO處理了馬鈴薯，并得出NO可以顯著降低馬鈴薯的失重率、腐爛率和萌芽率；延緩VC含量和可溶性固形物含量的下降；抑制還原糖的生成；提高了SOD酶的活性，顯著降低了乙烯釋放速率、呼吸強度、淀粉酶活性和PPO的活性。研究說明NO處理可以改善馬鈴薯的貯藏品質[10]。

由此，可以推斷出NO的處理影響果實內自由基、CAT、SOD、POD、LOX等酶的活性，從而延緩果蔬的成熟與衰老，但其具體的作用機理，還有待進一步的研究。

4 研究展望

當前，果蔬產(chǎn)品貯藏保鮮中常用低溫貯藏保鮮技術和氣調貯藏保鮮技術。低溫貯藏保鮮是以控制溫度為條件來抑制果蔬生理活性、抑制微生物的繁殖，其缺點是在貯藏中果蔬尚存在部分微生物繼續(xù)活動，并發(fā)生萎縮現(xiàn)象。氣調貯藏是較先進的果蔬保鮮法，發(fā)展較快，可以延緩果蔬衰老，減少乙烯對果蔬的刺激，降低腐爛率等，成為正在興起的研究熱潮。

NO廣泛存在于生物體中，不僅影響著物的生長發(fā)育等一系列生理過程，而且在信號轉導過程中擔任關鍵角色。適宜濃度NO處理具有效果明顯、省時省力、節(jié)約成本等優(yōu)點。因此，研究NO在果蔬產(chǎn)品貯藏保鮮中的應用技術有一定的理論和實際意義，開發(fā)潛力很大，值得深入探討。

今后可考慮從以下幾個方面深入研究：

1）對果蔬保鮮方面的機理進一步研究，并捕獲NO調控過程中保鮮基因表達水平與蔬菜保鮮效果之間的聯(lián)系。

2）調控內源NO代謝過程中含量變化進行產(chǎn)品保鮮的技術措施以及以NO保鮮不同園藝產(chǎn)品條件的優(yōu)化和技術體系的構建。

3）NO參與成熟衰老過程中的乙烯調控及其信號轉導過程，以及通過控制乙烯來延緩果蔬成熟與衰老的作用機理。

4）調控內源NO的含量代謝途徑和具體的作用機理。

5）NO通過對果蔬體內各種酶的作用機理，來延緩果蔬的衰老。

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