富硒大米中硒形態(tài)分析

方建軍，祝華明，方芳，龔鴻萍，張旭，鄭睿行

（衢州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)中心，浙江 衢州 324002）

硒是人體生命活動(dòng)中必需的微量元素之一[1]，近年來受到人們的廣泛關(guān)注。它具有使人體抗衰老、預(yù)防癌變、保護(hù)與修復(fù)營養(yǎng)細(xì)胞、解毒排毒、提高免疫力等多種生理功能，被稱為主宰生命的元素之一[2-4]。硒對(duì)人體的重要性已十分明確，但權(quán)威資料表明硒的功能隨其形態(tài)不同而異，食物中無機(jī)硒的存在對(duì)人體是有害的，無機(jī)形態(tài)的硒特別是六價(jià)硒毒性很大，對(duì)人體毫無營養(yǎng)可言。只有有機(jī)形態(tài)的硒，如硒蛋白、硒代氨基酸、硒多肽、硒多糖等，在機(jī)體內(nèi)才能轉(zhuǎn)變?yōu)樯砘钚晕镔|(zhì)，為人體所吸收利用[5]。

據(jù)調(diào)查，世界上有40多個(gè)國家和地區(qū)缺硒，我國也有72%的缺硒或低硒地區(qū)，其中近1/3為嚴(yán)重缺硒地區(qū)，而缺硒導(dǎo)致克山病的重要因素[6]。植物具有不同程度地吸收、利用和轉(zhuǎn)化土壤環(huán)境中硒的能力，是自然界硒生態(tài)循環(huán)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。生長(zhǎng)在高硒土壤上的植物硒含量顯著高于缺硒或低硒土壤上的植物。據(jù)浙江省國土廳資料表明，衢州市龍游縣有富硒土壤資源208平方公里，該縣盛產(chǎn)富硒蓮子，富硒大米，富硒油菜等特色農(nóng)產(chǎn)品。

目前，國內(nèi)外有關(guān)富硒農(nóng)產(chǎn)品與食品的研究并不多見，對(duì)有益硒形態(tài)的檢測(cè)與分析更是涉及甚少，但是有關(guān)補(bǔ)硒的保健品不少，盲目宣傳效果，導(dǎo)致消費(fèi)者難以識(shí)別產(chǎn)品優(yōu)劣。因此開展對(duì)富硒農(nóng)產(chǎn)品中有益硒形態(tài)分析技術(shù)研究十分必要，幫助人們合理明智的選擇健康的富硒產(chǎn)品，科學(xué)膳食，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用現(xiàn)代生物學(xué)的原理和先進(jìn)的光譜分析技術(shù)，研究了龍游縣富硒地帶的富硒大米中硒的賦存形態(tài)及分布規(guī)律，探索出為人體所能利用的有益硒的含量，為合理開發(fā)利用富硒大米，完善富硒大米標(biāo)準(zhǔn)提供了重要科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

富硒大米采自浙江省衢州市龍游縣志棠富硒地帶。

1.2 試驗(yàn)試劑

硝酸、鹽酸、高氯酸均為優(yōu)級(jí)純，氫氧化鈉、無水乙醇、氯仿、正丁醇、氨水、硼氫化鈉為分析純，硒標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 試驗(yàn)儀器

雙道原子熒光光度計(jì)（AFS-930）：北京吉天科學(xué)儀器有限公司；電熱板（DB-2A）：常州國華電器有限公司；粉碎機(jī)（FS10）：九陽股份有限公司；離心機(jī)（TGL-18M）：上海盧湘儀離心機(jī)有限公司；控溫?fù)u床（THZC）：江蘇太包市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；超純水儀（AD－SR20）：杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司。

1.4 儀器條件

負(fù)高壓：340 V；燈電流：100 mA；原子化溫度：800℃；爐高：8 mm；載氣流500 mL/min；屏蔽氣流速：1000 mL/min；測(cè)量方式：標(biāo)準(zhǔn)曲線法；讀數(shù)方式：峰面積；延遲時(shí)間：1 s；讀數(shù)時(shí)間：10 s；加液時(shí)間：8 s；進(jìn)樣體積：2 mL，進(jìn)樣方式：自動(dòng)進(jìn)樣。

1.5 方法

1.5.1 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

將硒標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成 0、4、8、12、16、20μg/L 的濃度梯度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 總硒含量測(cè)定及加標(biāo)回收試驗(yàn)

1.5.2.1 總硒含量測(cè)定

將大米在粉碎機(jī)中充分粉碎，然后稱取兩份0.30 g于 50mL三角瓶中，加 10mL 混合酸（HNO3∶HClO4=4∶1），冷消化過夜，次日于電熱板上加熱，并及時(shí)補(bǔ)加混合酸，當(dāng)溶液變?yōu)榍辶翢o色并伴有白煙時(shí)，再繼續(xù)加熱至剩余體積2 mL左右，切不可蒸干。冷卻，再加5 mL 6 mol/L鹽酸，繼續(xù)加熱至溶液變?yōu)榍辶翢o色并伴有白煙出現(xiàn)，以完全將六價(jià)硒還原成四價(jià)硒。冷卻，轉(zhuǎn)移定容至50 mL容量瓶中，同時(shí)做空白試驗(yàn)。吸取2 mL試樣消化液于10 mL比色管中，加濃鹽酸2 mL，加水定容至10 mL，混勻進(jìn)行氫化物原子熒光法測(cè)定總硒含量[7]。

1.5.2.2 加標(biāo)回收試驗(yàn)

稱取大米干粉0.30g兩份，每份樣品中加入10μg/L的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液6mL，使加入樣品的硒含量為200μg/kg，按1.5.2.1處理，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，并計(jì)算回收率。

1.5.3 有機(jī)硒含量測(cè)定

稱取經(jīng)過粉碎機(jī)充分粉碎的大米干粉1.00 g，加少量超純水后，在研砵中碾磨使細(xì)胞充分破裂，定量轉(zhuǎn)移至事先準(zhǔn)備好的透析袋中，用超純水在燒杯中透析24 h，每6小時(shí)離心更換一次超純水，將透析后的樣品取出，在離心機(jī)中12000 r/min離心15 min，取沉淀。按照1.5.2中的方法測(cè)定硒含量，并分析有機(jī)硒占總硒的比例。

1.5.4 堿溶性蛋白質(zhì)提取及其結(jié)合態(tài)硒含量測(cè)定[8-10]

稱取經(jīng)過粉碎機(jī)粉碎的大米干粉10.00g，于500mL三角瓶中，加0.05 mol/LNaOH溶液100 mL在搖床中振蕩提取2 h，將混合液以12000 r/min離心15 min，取上清液，加入0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH=5.5，以12000 r/min離心15 min得到蛋白質(zhì)沉淀物，在真空干燥器中干燥。將得到的蛋白質(zhì)提取物稱量后，按照1.5.2.1中的方法測(cè)定硒含量，并分析大米中堿溶性蛋白結(jié)合態(tài)的硒含量，及其占有機(jī)硒的比例。

1.5.5 多糖提取[11]及其結(jié)合態(tài)硒含量測(cè)定

稱取經(jīng)過粉碎機(jī)充分粉碎的大米干粉2.00 g，加入100 mL的0.5 mol/LNaOH溶液，水浴80℃加熱2 h提取多糖，12000 r/min離心15 min，除去殘?jiān)逡河寐确隆谜〈迹?4∶1）洗蛋白3次，加入無水乙醇至溶液最終乙醇濃度為80%，靜置24 h，收集沉淀，在真空干燥器中干燥。將得到的多糖提取物稱量后，按照1.5.2.1中的方法測(cè)定硒含量，并分析大米中多糖結(jié)合態(tài)的硒含量，及其占有機(jī)硒的比例。

1.5.6 RNA提取及其結(jié)合態(tài)硒含量測(cè)定[12]

取大米干粉10.00 g，加200 mL 0.025 mol/LNaOH溶液搖床振蕩45 min，用3 mol/L鹽酸中和至pH=7.0，攪拌10 min然后加熱至90℃保持10 min冷卻至10℃，在12000 r/min離心15 min，棄沉淀，上清液用6 mol/L的鹽酸調(diào)pH2.5，冷室靜置過夜，12000 r/min離心15 min，收集沉淀加1滴～2滴氨水，30 mL蒸餾水溶解沉淀，用氯仿∶正丁醇（24∶1）洗滌蛋白質(zhì)3次，將得到的水相在烘箱中60℃烘干稱重，按照1.5.2.1中的方法測(cè)定硒含量，并分析大米中RNA結(jié)合態(tài)的硒含量，及其占有機(jī)硒的比例。

1.5.7 精密度試驗(yàn)

精確稱取大米干粉樣品0.30 g，平行樣品共6個(gè)，處理方法同1.5.2.1，檢測(cè)總硒含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過方法1.5.1得到不同濃度硒標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)的熒光值結(jié)果如表1。

表1 不同濃度硒標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)的熒光值Table1 Fluorescence value of different concentration Selenium standard solution

2.2 堿溶性蛋白及多糖提取

通過方法1.5.4，1.5.5得到結(jié)果如圖1，圖2。

圖1 大米蛋白Fig.1 Rice protein

圖2 大米多糖Fig.2 Rice polysaccharide

按方法1.5.4，1.5.5及 1.5.6得到圖 1大米蛋白0.47 g，圖2大米多糖0.39 g，RNA0.41 g，取適量的蛋白，多糖及RNA，按方法1.5.2.1操作，分析其硒含量，分析報(bào)告中蛋白硒平均值為1918.947μg/kg，多糖硒平均值為 80.357μg/kg，RNA 硒平均值為 76.572μg/kg，并根據(jù)以下式子計(jì)算大米中對(duì)應(yīng)結(jié)合形態(tài)的硒含量。

大米中蛋白結(jié)合態(tài)硒含量=蛋白質(zhì)中硒含量×蛋白質(zhì)的質(zhì)量/大米的質(zhì)量

大米中多糖結(jié)合態(tài)硒含量=多糖中硒含量×多糖的質(zhì)量/大米的質(zhì)量

大米中RNA結(jié)合態(tài)硒含量=RNA中硒含量×RNA的質(zhì)量/大米的質(zhì)量

2.3 總硒、蛋白硒、多糖硒及RNA硒含量

對(duì)大米樣品的總硒、蛋白硒、多糖硒及RNA硒含量進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 總硒、蛋白硒、多糖硒及RNA硒含量Table2 Content of total,protein,polysaccharide and RNA selenium μg/kg

2.4 大米中有機(jī)硒的主要賦存形態(tài)及其比例特征

由表2得到餅圖結(jié)果見圖3，圖4。

圖3 有機(jī)硒和無機(jī)硒的比例Fig.3 Organic selenium and inorganic selenium ratio

圖4 不同硒形態(tài)占有機(jī)硒的比例Fig.4 Different selenium form of organic selenium ratio

由表2和圖3可知，大米中總硒含量為206.708μg/kg，有機(jī)硒含量為168.875μg/kg，有機(jī)硒占總硒的81.70%。由圖4可知，有機(jī)硒中硒最主要的賦存形態(tài)是堿溶性蛋白硒占53.40%，其次多糖硒占9.28%，RNA硒占1.86%，其它形態(tài)的有機(jī)硒占35.46%。

2.5 精密度試驗(yàn)

通過方法1.5.7試驗(yàn)結(jié)果如表3。

表3 精密度試驗(yàn)Table 3 The accuracy test

通過方法1.5.7試驗(yàn)結(jié)果如表3，6個(gè)平行樣品總硒檢測(cè)結(jié)果重現(xiàn)性良好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為0.966%，表明該方法具有很好的精密度。

2.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)

通過方法1.5.2.2做樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果如下表4。

表4 加標(biāo)回收試驗(yàn)Table 4 The addition standard recovery test

通過方法1.5.2.2做樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果如上表4回收率為103.12%，說明該方法準(zhǔn)確度良好。

3 結(jié)論

富硒大米作為一種富含天然硒的特色農(nóng)產(chǎn)品，已逐步被廣大消費(fèi)者所接受，本研究采用原子熒光光度法測(cè)定了富硒大米中硒含量，并分析了硒在大米中主要的賦存形態(tài)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，富硒大米中的總硒含量為 206.708μg/kg，達(dá)到 60μg/kg～300μg/kg 的富硒標(biāo)準(zhǔn)，而硒主要以有機(jī)硒形態(tài)存在，占總硒含量的81.70%，有機(jī)硒中硒最主要的賦存形態(tài)是堿溶性蛋白硒占53.40%，其次多糖硒占9.28%，RNA硒占1.86%，其它形態(tài)的有機(jī)硒占35.46%。測(cè)量硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)是r=0.9997，樣品中硒的加標(biāo)回收率為103.12%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.966%，試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，該方法準(zhǔn)確度高，精密度好，回收率高，符合試驗(yàn)要求。本研究認(rèn)為，天然富硒大米中有機(jī)硒含量高，形態(tài)豐富，多能為人體吸收利用，因此合理開發(fā)利用富硒大米，對(duì)于正確引導(dǎo)消費(fèi)，促進(jìn)人體健康安全，發(fā)展富硒地帶特色農(nóng)業(yè)具有重大意義。

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