獼猴桃根提取物體外抗氧化作用的研究

楊艷杰，何弘水

（漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 漯河 462002）

氧在生物體內(nèi)通過單電子還原產(chǎn)生化學(xué)性質(zhì)活潑的物質(zhì)稱為活性氧，包括超氧陰離子自由基（·O2-）、過氧化氫（H2O2）、羥基自由基（·OH）等[1]?；钚匝醯陌胨テ诤芏?，但它們可以與多元不飽和脂肪酸作用，造成脂質(zhì)過氧化。脂質(zhì)過氧化是造成生物體氧化損傷的主要原因。不飽和脂肪酸是生物膜的基本組成成分，極易被活性氧氧化損傷，造成生物膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞，從而誘發(fā)多種慢性疾病[2]。因此，消除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)重要課題。本實(shí)驗(yàn)從清除DPPH自由基、清除·O2-、清除H2O2，抑制·OH、還原力等方面比較獼猴桃根提取物的抗氧化效果，為獼猴桃根生物活性成分的綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

HP8453紫外可見分光光度計(jì)：美國惠普；pH25-S型酸度計(jì)：北京華瑞博遠(yuǎn)科技公司；800型離心沉淀器：河南斯泰儀器有限公司。

1.2 試劑

還原性輔酶Ⅰ（NADH），二甲基酚嗪硫酸鹽（PMS），氮四唑藍(lán)（NBT），二苯基苦基苯（DPPH），菲洛嗪，氯化亞鐵，氯化鐵，亞鐵氰化鉀（K4[Fe（CN）6]），鄰菲咯啉，過氧化氫，三氯乙酸（CCl3COOH），鉬酸銨[（NH4）2MoO4]，硫代硫酸鈉（NaS2O3），碘化鉀，淀粉，VC，硫脲，乙酸乙酯，無水乙醇。試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為重蒸餾水（ddH2O）。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品（獼猴桃根提取液）制備

獼猴桃根10 kg切碎，80℃以下烘干至水分小于10%，粉碎小于20目，用乙醇（65%）45℃以下回流提取3次，提取液于50℃減壓濃縮，得約300 g深黃色流浸膏，然后取200 g膏狀物，加入適量蒸餾水，攪成糊狀混合液，依次用乙酸乙酯萃取3次（每次500 mL），合并提取液，減壓回收溶劑得獼猴桃根提取固體，用65%乙醇精確配制成濃度分別為 5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0、200.0、400.0、600.0、800.0μg/mL 和 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL 的樣品（ERHM）溶液。

2.2 ERHM對DPPH自由基的消除作用

同時(shí)計(jì)算清除DPPH的半數(shù)有效濃度EC50。用VC作對照，進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。ERHM對DPPH有較強(qiáng)的清除作用，且呈現(xiàn)濃度依賴性。VC的EC50為7.2μg/mL，ERHM 的 EC50為 8.03μg/mL。

2.3 ERHM對超氧陰離子（·O2-）的清除作用

參考Liu等[4]的方法檢測ERHM對超氧陰離子的清除能力。取不同濃度的ERHM溶液0.3mL分別加入由120μmol/L的PMS、936μmol/L的NADH、300μmol/L的NTB溶液（均用0.1 mol/L的pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液配制）各0.75 mL所建立的反應(yīng)體系中，混勻，室溫靜置反應(yīng)10 min，于560 nm處測定吸光度值A(chǔ)0；以65%乙醇代替ERHM，560 nm處測定A0；以磷酸鹽緩沖溶液代替PMS溶液，在560 nm處測定A2；65%乙醇調(diào)零。均平行測定3次。對超氧陰離子清除率和EC50的計(jì)算方法同前。ERHM對超氧陰離子具有較強(qiáng)的清除作用，在 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL 時(shí)，清除率分別是 35.57%、48.65%、66.74%、72.11%、76.18%，EC50為1.28 mg/mL。

2.4 ERHM對羥基自由基（·OH）的抑制能力

參考Fenton反應(yīng)體系[5]檢測ERHM抑制羥基自由基（·OH）的能力。反應(yīng)體系組成：60μL 1.0 mmol/L Fe2+溶液，90μL 1.0 mmol/L 鄰菲咯啉溶液，150μL 0.12%H2O2溶液，2.4 mL pH=7.8的磷酸鹽緩沖溶液，分別加入不同濃度的ERHM溶液300μL，混勻，室溫反應(yīng)20 min，510 nm處測定A1；65%乙醇代替抗氧化劑，測定A0；pH=7.8的磷酸鹽緩沖溶液代替鄰二氮菲，測定A2，65%乙醇調(diào)零。均平行測定3次。清除率及EC50計(jì)算方法同前。結(jié)果見圖2。

在0～4 mg/mL，ERHM抑制羥基自由基的能力呈現(xiàn)濃度依賴性。ERHM濃度達(dá)5.0 mg/mL時(shí)，抑制羥基自由基（·OH）能力可達(dá)69.4%，其EC50為1.57 mg/mL。

2.5 還原力比較

參考Oyaizu方法[6]依次加入0.75 mL磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.6）、0.75 mL 1%的 K4[Fe（CN）6]、0.75 mL 不同濃度的ERHM溶液，混勻，50℃水浴30 min，冰水浴冷卻，加入0.75 mL 1%CCl3COOH，4℃下離心10 min（3000 r/min）。取上清液1.5 mL，加入 ddH2O 1.5 mL、1%FeCl30.75 mL，混勻，室溫靜置 10 min，700 nm 處測定A1；以ddH2O代替ERHM溶液，測定A0；ddH2O調(diào)零。均平行測定3次。以110 mg/mL VC在700 nm處的A為標(biāo)準(zhǔn)，按下式計(jì)算相對還原力：RP=×100%，結(jié)果見圖3。

同時(shí)計(jì)算ERHM還原力的EC50。ERHM還原力較強(qiáng)，其EC50為0.28 mg/mL，約是VC（EC50為0.08 mg/mL）的3.5倍。

2.6 ERHM對H2O2的消除能力

H2O2是強(qiáng)氧化劑，且易透過細(xì)胞膜，并引起氧化損傷。本實(shí)驗(yàn)采用置換滴定法檢測H2O2濃度。取不同濃度的ERHM溶液各1.0 mL分別與1.0 mL 0.1 mol/mL H2O2混合，加入 2 滴 3%的（NH4）2MoO4、2 mol/L H2SO410 mL、1.8 mol/L KI 7.0 mL，用 0.005 mol/L NaS2O3滴定，待體系變黃，加入1 mL淀粉溶液，繼續(xù)滴定到無色即為終點(diǎn)。滴定樣品試劑的體積為V1，滴定H2O2所用體積為V0。平行滴定3次。計(jì)算清除率100%。結(jié)果見圖4。

結(jié)果顯示樣品ERHM對過氧化氫具有一定的消除作用，在濃度為100μg/mL時(shí)對過氧化氫的清除率為42%，比VC要小（同樣條件下VC清除率為91%）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ERHM具有較強(qiáng)的還原力，這與較強(qiáng)抑制羥基自由基的產(chǎn)生及消除過氧化氫有關(guān)，同時(shí)也具有消除DPPH和超氧陰離子等活性氧的能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了ERHM的多方面抗氧化活性，且隨其濃度增加而增大。所以，ERHM有效成分具有較為顯著的抗氧化作用。

現(xiàn)代研究已經(jīng)證實(shí)，在生命活動(dòng)的氧化代謝過程中會(huì)不斷產(chǎn)生各種自由基，其中超氧陰離子、過氧化氫、羥基自由基等引起的細(xì)胞損傷過程是微粒體脂質(zhì)過氧化和多不飽和脂肪酸（PUFA）氧化變性的主要原因[2]。當(dāng)PUFA遭受到氧化損傷時(shí)細(xì)胞即失去完整性，破壞了鑲嵌于膜系統(tǒng)上的許多酶的空間構(gòu)型，使得酶的空隙擴(kuò)大、通透性增加，出現(xiàn)退行性變化，從而使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、線粒體膜、溶酶體膜等生物膜系統(tǒng)的鑲嵌狀態(tài)發(fā)生變化，導(dǎo)致廣泛損傷和病變。自由基一般都不穩(wěn)定，壽命很短，檢測自由基的清除能力是評價(jià)抗氧化物質(zhì)抗氧化活性的重要方法。還原力反映了一種物質(zhì)作為電子供體的能力，藥物還原力和捕獲過氧化氫能力的大小在一定程度上反映了其預(yù)防性抗氧化功能的強(qiáng)弱。

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