覆盆子干果黃酮提取研究

孫金旭

（衡水學(xué)院生命科學(xué)系，河北 衡水 053000）

覆盆子（raspberry）又稱樹莓、大號角公，薔薇科懸鉤子屬漿果植物。主產(chǎn)于浙江、福建、四川、陜西、安徽、江西、貴州等地。覆盆子果實(shí)富含氨基酸、礦質(zhì)元素、有機(jī)酸和VE[1-2]人體必需的營養(yǎng)素外，還含有黃酮、多糖、粗三萜等功能性物質(zhì)。

目前對于黃酮提取的方法主要有水煎煮法、乙醇提取法、加助溶劑提取法、超聲波法、超濾法、微波提取法、高速逆流色譜法、亞臨界水提法等多種方法[3]。各種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，該實(shí)驗(yàn)對乙醇提取法進(jìn)行了研究，采用單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化了覆盆子黃酮提取的工藝條件。

1 材料與儀器

1.1 材料

覆盆子干果（一級品）：購于衡水市中醫(yī)院藥店，凈制粉碎過40目篩，50℃烘干備用。樣品成分分析中所用化學(xué)試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器

XFB-200粉碎機(jī)：湖南忠誠制藥機(jī)械廠；HH-6恒溫水浴鍋：上?？等A生化儀器廠；Uitrospec 3300 pro紫外可見分光光度計；美國GE公司。

2 方法

2.1 總黃酮含量的測定[4]

樣品液測定方法為：（1）準(zhǔn)確量取待測液5.00 mL，其余操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的測定方法，測定待測液吸光度。（2）準(zhǔn)確量取待測液5.00 mL，加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液2.00 mL，其余操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的測定方法，測定混合液的吸光度。（3）測定標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知蘆丁含量與吸光度存在良好的線性關(guān)系。 總黃酮濃度計算公式為：

式中：A為分光光度法測定覆盆子提取液吸光度值；C為覆盆子提取液黃酮濃度，（mg/mL）；B為覆盆子黃酮提取量，（mg/g）；V為覆盆子黃酮提取液總體積，mL；Z為覆盆子干果總質(zhì)量，g。

2.2 各單因素對黃酮提取率的影響

選定不同濃度乙醇、提取時間、溫度等3個因素，主要以總黃酮提取率作為指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)考察。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化黃酮提取因素水平

響應(yīng)面法優(yōu)化黃酮提取因素水平，見表1。

表1 響應(yīng)面法黃酮提取因素水平表Table 1 The factors and levels of response surface for flacone extracting

3 結(jié)果與討論

3.1 乙醇濃度對黃酮提取量的影響

稱取覆盆子干果10 g分為6份，粉碎至粒度為（300μm～400μm），放入燒杯中，按 50%、60%、70%、80%、90%、100%的比例將乙醇分別加入1∶10的料液中，80℃下，提取6 h，測定黃酮濃度，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，隨乙醇濃度不斷增加，提取黃酮濃度不斷增大，當(dāng)乙醇濃度為70%，黃酮濃度達(dá)到最大，為2.01 mg/g，之后隨乙醇濃度增加，黃酮濃度反而下降，因此，70%的乙醇濃度為最適覆盆子黃酮提取的濃度。

3.2 浸提溫度對黃酮提取量的影響

稱取覆盆子干果10 g，分為6份，粉碎至粒度為（300μm～400μm），放入燒杯中，料液比例為 1∶10，乙醇濃度70%，提取時間6 h，提取溫度分別為50、60、70、80、90、100 ℃，提取結(jié)束后測定黃酮濃度，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨浸提溫度不斷升高，黃酮提取濃度不斷增加，當(dāng)浸提溫度為90℃時，黃酮浸提濃度達(dá)到最大為2.15 mg/g，之后黃酮浸提濃度有所下降，因此，90℃為黃酮浸提的最適溫度。

3.3 浸體時間對黃酮提取量的影響

稱取覆盆子干果10 g，分為6份，粉碎至粒度為（300μm～400μm），放入燒杯中，料液比例為 1∶10，乙醇濃度70%，提取溫度90℃，浸體時間分別為4、5、6、7、8、9 h，結(jié)果如圖 4 所示。

由圖4可知，隨提取時間的延長，黃酮提取濃度也依次增加，到8 h時，黃酮提取濃度達(dá)到最高，最高提取量為2.23 mg/mL，當(dāng)高于8 h時，黃酮提取濃度下降，故8 h的提取時間為黃酮提取的最佳時間。

3.4 黃酮提取工藝優(yōu)化

3.4.1 覆盆子黃酮提取響應(yīng)面數(shù)據(jù)方案及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，考慮到實(shí)驗(yàn)的可操作性，將料液比例設(shè)定為1∶15，采用響應(yīng)面分析法進(jìn)行設(shè)計，對提取溫度、提取時間、乙醇濃度三因素三水平共15個試驗(yàn)點(diǎn)（3個中心點(diǎn)）的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，運(yùn)用SAS軟件的 RSREG（Response surface regression）程序?qū)?5個試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析。以覆盆子干果黃酮提取濃度為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后,確定函數(shù)表達(dá)式。試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面數(shù)據(jù)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The data plan and result for response surface

3.4.2 模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

對回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)、方差分析及各因素最佳點(diǎn)值分析，采用SAS RSREG程序?qū)Ρ?數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA分析，結(jié)果見表3。

表3 三因素三水平中心組和參數(shù)估計Table 3 The parameter estimating and central division for three facters and levels

續(xù)表3 三因素三水平中心組和參數(shù)估計Continue table 3 The parameter estimating and central division for three facters and levels

該方程回歸顯著，模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方即R2=97.64%，說明回歸方程的擬合程度良好，失擬較小，可以用該方程代替真實(shí)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析。由表3中的 P 值可知道，方程中 X1、X2、X3、X1X1和 X3X3對 Y值的影響達(dá)顯著水平，表明實(shí)驗(yàn)因子對響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系，二次項(xiàng)對響應(yīng)值也有很大的關(guān)系，這和模型回歸中的線性和平方項(xiàng)影響顯著相對應(yīng)。交互項(xiàng)系數(shù)均不顯著，所以交互作用的影響相對較小。失擬項(xiàng)的p=0.2320，沒有顯著性影響，說明數(shù)據(jù)中沒有異常點(diǎn)，不需要引入更高次數(shù)的項(xiàng)，模型適當(dāng)。

用Design Expert軟件對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，選擇對響應(yīng)值顯著的各項(xiàng)，可得提取乙醇濃度、提取時間、提取溫度與黃酮提取濃度之間的多項(xiàng)回歸方程，回歸方程為:

通過軟件分析，得到覆盆子黃酮提取量最大時X1=0.1173；X2=0.3927；X3=0.2663 計算得到最佳工藝條件為：乙醇濃度91%，提取溫度74℃、提取時間8.3 h。此條件下，黃酮提取量為2.54 mg/g。為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化提取條件進(jìn)行提取試驗(yàn)，實(shí)際測得的平均值為2.53 mg/g，與理論預(yù)測值相比，其相對誤差約為1%，因此，基于響應(yīng)曲面法所得的覆盆子干果黃酮提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價值。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)證明響應(yīng)面方法是優(yōu)化發(fā)酵條件非常有效的工具，Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計能建立主要因素影響覆盆子黃酮提取的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，并利用統(tǒng)計學(xué)方法對該模型進(jìn)行了顯著性檢驗(yàn)，優(yōu)化了內(nèi)在因素水平，找出最佳值。本研究經(jīng)響應(yīng)面方法優(yōu)化，得出產(chǎn)覆盆子黃酮提取的最佳工藝參數(shù)為：乙醇濃度91%，提取溫度74℃、提取時間8.3 h。此條件下，方程預(yù)測值和驗(yàn)證試驗(yàn)值相差1%，覆盆子黃酮的最大提取量達(dá)到2.53 mg/g。

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