干法糖基化改性提高大豆分離蛋白的乳化性

趙海賢，于國(guó)萍

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆分離蛋白含人體所必需的8種氨基酸，且比例比較合理，現(xiàn)已成為重要的蛋白資源和優(yōu)良的食品原料[1]。在大豆分離蛋白的制備和加工過程中,應(yīng)用不同的處理方法,都會(huì)引起蛋白質(zhì)理化性質(zhì)發(fā)生變化,經(jīng)適當(dāng)改性可產(chǎn)生所期望功能性質(zhì),提高其作為功能性成分在食品工業(yè)中應(yīng)用。

目前蛋白質(zhì)的改性有物理、化學(xué)和酶等方法。糖基化改性是化學(xué)改性的一種，該反應(yīng)基于美拉德（Maillard）反應(yīng)，不需要任何化學(xué)試劑作為催化劑，僅加熱就可使該反應(yīng)自發(fā)地進(jìn)行，經(jīng)接枝改性的蛋白質(zhì)功能性有很大的提高，是目前蛋白改性眾多方法中較為理想的方法[2]。

乳化性是蛋白質(zhì)可應(yīng)用性的一個(gè)很重要的指標(biāo)，它與蛋白質(zhì)的溶解性、凝膠性和起泡性等有著密切的關(guān)系，直接關(guān)系到蛋白質(zhì)在食品工業(yè)中的應(yīng)用，因而通過改性提高蛋白的乳化性是及其必要的。已有文獻(xiàn)報(bào)道，糖基化改性是提高蛋白乳化性的一種有效途徑。Nakamura等合成的溶菌酶-葡聚糖的共價(jià)復(fù)合物具有很好的乳化特性，并且提高了溶菌酶的抗菌范圍[3]，Moreno將酪蛋白與乳糖在40℃條件下反應(yīng)，乳化性得到明顯改善[4]。本論文旨在通過糖基化改性，使大豆分離蛋白與葡聚糖發(fā)生干法接枝反應(yīng)，改善大豆分離蛋白的乳化性能，從而實(shí)現(xiàn)大豆分離蛋白功能特性的有效改善和充分利用，解決植物蛋白開發(fā)功能性食品配料的問題。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白：哈爾濱高科大豆食品公司；非轉(zhuǎn)基因九三大豆油：市售；葡聚糖2萬(wàn)（右旋糖酐）：Sigma公司。

FD-1PF冷凍干燥機(jī)：上海田楓實(shí)業(yè)有限公司；YQ-3型電動(dòng)勻漿機(jī)：江蘇江陰科研器械廠；722-2000型分光光度計(jì)：山東高密彩虹分析儀器有限公司；BIO-RAD Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳儀：美國(guó)伯樂公司。

1.2 方法

1.2.1 糖基化蛋白的制備

將不同質(zhì)量比的大豆分離蛋白與葡聚糖的混合物溶于pH 7.8,0.067 mol/L的磷酸鹽緩沖液中[蛋白濃度5%（g/mL）]，磁力攪拌使其充分溶解，然后將混合液冷凍干燥，將冷凍干燥的固體樣品磨碎達(dá)到2種原料充分混合的效果。將一定量的粉末裝入稱量瓶中，放在裝有KBr飽和溶液的密閉容器中（相對(duì)濕度為79%），在60℃下進(jìn)行Maillard反應(yīng)制備糖基化蛋白[5]，分別在不同的時(shí)間取樣待測(cè)。

1.2.2 乳化活性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

采用濁度法[6]，具體操作如下：

將糖基化蛋白樣品溶于pH 7.0的0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液中，使其濃度為0.1%（g/mL），取30 mL的待測(cè)糖基化蛋白樣品溶液，加入10 mL的大豆油，在10000 r/min轉(zhuǎn)速下分散1 min，分別于0和10 min從溶液底部吸取100μL乳濁液，加到10 mL 0.1%SDS溶液中，于500 nm處測(cè)定吸光值，以0.1%SDS溶液為空白。用零時(shí)刻的吸光值A(chǔ)0表示乳化活性（EA），乳化穩(wěn)定性用ES＝A0×10/（A0－A10）表示，其中A10－將乳狀液放置10 min后測(cè)得的乳化活性值。

1.2.3 各種因素對(duì)糖基化蛋白乳化性的影響

1.2.3.1 干熱反應(yīng)時(shí)間對(duì)糖基化蛋白乳化性的影響

在糖-蛋白質(zhì)量比為 2∶1，pH=7.8，T=60 ℃，相對(duì)濕度79%的條件下，改變反應(yīng)時(shí)間分別為 6、12、18、24、30 h，制備糖基化蛋白，按1.2.2方法測(cè)定糖基化蛋白的乳化性。

1.2.3.2 干熱反應(yīng)溫度對(duì)糖基化蛋白乳化性的影響

在糖-蛋白質(zhì)量比為 2∶1，pH=7.8，t=18 h，相對(duì)濕度79%的條件下，改變反應(yīng)溫度分別為40、50、60、70、80℃，制備糖基化蛋白，按1.2.2方法測(cè)定糖基化蛋白的乳化性。

1.2.3.3 糖-蛋白質(zhì)量比對(duì)糖基化蛋白乳化性的影響

在溫度60℃，反應(yīng)時(shí)間18 h，pH 7.8，大豆分離蛋白用量不變的條件下，改變糖-蛋白質(zhì)量比分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，制備糖基化蛋白，按 1.2.2 方法測(cè)定糖基化蛋白的乳化性。

1.2.3.4 乳化體系的pH對(duì)糖基化蛋白乳化性的影響

在糖-蛋白質(zhì)量比為 2∶1，t=18 h，T=60 ℃，pH 7.8，相對(duì)濕度79%的條件下制備糖基化蛋白，改變?nèi)榛w系的 pH 分別為 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12[7]，按 1.2.2方法測(cè)定糖基化蛋白的乳化性。

1.2.4 糖基化改性提高大豆分離蛋白乳化性條件的優(yōu)化

影響Maillard反應(yīng)的因素很多，出于實(shí)驗(yàn)的綜合考慮，確定相對(duì)濕度為79%，乳化液中蛋白濃度為0.1%，分別對(duì)糖蛋白制備的反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)溫度，糖-蛋白質(zhì)量比，乳化液的pH進(jìn)行四因素三水平L9（34）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

1.2.5 凝膠電泳分析

糖基化蛋白分子量的分布用十二烷基磺酸鈉聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS－PAGE）進(jìn)行分析。SDS-PAGE凝膠配方為：10%分離膠和5%濃縮膠（含0.1%SDS）。濃縮膠電壓控制在80 V，分離膠電流控制在120 V[8]。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

文中數(shù)據(jù)為3次測(cè)定值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用SPSS13.0軟件的One Way ANOVA對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析（p＜0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 干熱反應(yīng)時(shí)間對(duì)糖基化蛋白乳化性的影響

干熱反應(yīng)時(shí)間對(duì)糖基化蛋白乳化性的影響如圖1所示。

從圖1中可以看出，不同時(shí)間的大豆分離蛋白-葡聚糖干熱反應(yīng)復(fù)合物的乳化能力均有很大程度提高。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間小于18 h時(shí)，時(shí)間對(duì)乳化活性（EA）的影響顯著（P<0.05），當(dāng)時(shí)間達(dá)到18 h后，乳化活性增長(zhǎng)趨勢(shì)漸緩，而乳化穩(wěn)定性隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在反應(yīng)時(shí)間為18 h時(shí)，乳化穩(wěn)定性（ES）達(dá)到最大值。

蛋白質(zhì)與多糖的接枝反應(yīng)中，反應(yīng)開始時(shí)，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)部分展開，多糖與蛋白質(zhì)受熱逐步結(jié)合，促進(jìn)SPI球狀分子伸展，疏水基團(tuán)暴露，從而大大提高了溶液的乳化活性。但是加熱時(shí)間過長(zhǎng)，一方面使蛋白質(zhì)分子的一些賴氨酸被破壞，另一方面造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的伸展，增加蛋白質(zhì)的相互作用，導(dǎo)致凝聚和沉淀，不利于蛋白質(zhì)與多糖發(fā)生相互作用[9]。而且隨著時(shí)間的進(jìn)行，混合樣品的顏色由淺變深（即發(fā)生Maillard褐變），不利于產(chǎn)品的應(yīng)用。因此時(shí)間選擇在18 h，乳化活性（EA）和乳化穩(wěn)定性（ES）都較高，分別是其相同條件下對(duì)照樣（反應(yīng)時(shí)間為0 h）的1.63倍和1.81倍，且褐變程度相對(duì)較小。

2.2 干熱反應(yīng)溫度對(duì)糖基化蛋白乳化性的影響

干熱反應(yīng)溫度對(duì)糖基化蛋白乳化性的影響如圖2所示。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，溫度對(duì)復(fù)合物乳化性的影響顯著（P<0.05）。大豆分離蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性隨著反應(yīng)溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)溫度小于60℃時(shí)，乳化活性隨著溫度的升高而上升。當(dāng)溫度大于60℃時(shí)，乳化活性隨著溫度的升高而下降。而對(duì)于乳化穩(wěn)定性來(lái)說，溫度為70℃時(shí)最好，但隨著溫度的升高，副反應(yīng)（Maillard褐變）程度加深，所以選擇60℃為反應(yīng)溫度。此時(shí)乳化活性和乳化穩(wěn)定性均較高，分別是其相同條件下對(duì)照樣（反應(yīng)時(shí)間為0 h）的1.57倍和1.32倍。

2.3 糖-蛋白質(zhì)量比對(duì)糖基化蛋白乳化性的影響

糖-蛋白質(zhì)量比對(duì)糖基化蛋白乳化性的影響如圖3所示。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，底物配比對(duì)乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響顯著（P<0.05）。乳化活性和乳化穩(wěn)定性都是隨著底物配比的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在葡聚糖與蛋白之比為2∶1時(shí)，二者均取得最大值。此時(shí)乳化活性和乳化穩(wěn)定性是相同條件下蛋白對(duì)照樣（反應(yīng)時(shí)間為0 h）的1.52倍和1.70倍。

蛋白和多糖的分子間共價(jià)鍵合是在一定的基團(tuán)間進(jìn)行的。為了得到具有一定乳化能力的復(fù)合物,要求反應(yīng)物的配比適當(dāng),以期實(shí)現(xiàn)最佳比例的鍵合。理想的產(chǎn)物應(yīng)該是蛋白的一部分疏水基團(tuán)與多糖發(fā)生共價(jià)鍵合增加復(fù)合物的親水性，但又能保留有足夠的疏水基團(tuán)來(lái)維持產(chǎn)物的表面活性[10]。適當(dāng)?shù)牡孜锱浔炔粌H可以提高反應(yīng)的速度和最終的反應(yīng)程度，而且還可以減少副反應(yīng)（如焦糖化）的發(fā)生[11]。

2.4 乳化液的pH對(duì)糖基化蛋白乳化性的影響

不同pH下糖基化改性大豆分離蛋白和大豆分離蛋白的乳化性的變化如圖4，圖5所示。

圖4顯示大豆分離蛋白的乳化活性受pH影響較大，相同pH下糖基化改性大豆分離蛋白的乳化活性明顯高于未改性的大豆分離蛋白。在pH 3～5之間，由于等電點(diǎn)的出現(xiàn)，使其溶解性下降，因而導(dǎo)致了其乳化活性的下降，隨后乳化活性呈緩慢上升的趨勢(shì)，直到pH達(dá)到8時(shí)，乳化活性達(dá)到最大，隨后隨著pH的增大，乳化活性成下降趨勢(shì)；乳化穩(wěn)定性的變化趨勢(shì)（見圖5）與乳化活性相似，只是糖基化產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性的最高的pH為7.0.這可能是因?yàn)樵趶?qiáng)堿條件下

SPI降解成小分子，減少了相互作用，體系對(duì)油的包容作用減弱，從而乳化性能下降[12]。

2.5 糖基化改性提高糖基化蛋白乳化性條件的優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析見表1，表2，表3。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Result of L9(34)orthogonal experiment

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析（乳化活性）Table 2 Analysis of L9(34)orthogonal experiment(emulsifying activity)

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析（乳化穩(wěn)定性）Table 3 Analysis of L9(34)orthogonal experiment(emulsifying stability)

正交試驗(yàn)結(jié)果分析見表2和表3，由表2可以得出干法糖基化改性提高大豆分離蛋白乳化活性的最佳工藝條件為A3B3C2D3。即：反應(yīng)溫度70℃，反應(yīng)時(shí)間24 h，糖-蛋白（2∶1），pH 8。其影響因素的重要性依次為：反應(yīng)溫度>反應(yīng)時(shí)間>pH>底物配比。由表3可以得出干法糖基化改性提高大豆分離蛋白乳化穩(wěn)定性的最佳工藝條件為 C3B3A3D3，即：糖-蛋白（3∶1），反應(yīng)時(shí)間24 h，反應(yīng)溫度70℃，pH 8。其影響因素的重要性依次為：底物配比>反應(yīng)時(shí)間>反應(yīng)溫度>pH。由此可知本試驗(yàn)檢測(cè)的幾個(gè)條件對(duì)糖基化蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響是不完全相同的，在反應(yīng)溫度70℃，反應(yīng)時(shí)間24 h，pH 8的條件下，糖-蛋白比為 2∶1時(shí)，糖基化蛋白的乳化活性最高。而糖-蛋白比為3∶1時(shí)，乳化穩(wěn)定最高，在各自最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，制得糖基化蛋白的乳化活性為0.83，乳化穩(wěn)定性為59.28，分別是其相同條件下對(duì)照樣的1.66倍和2.06倍。

2.6 SDS-PAGE分析

為了證實(shí)大豆分離蛋白-葡聚糖之間發(fā)生接枝反應(yīng)，進(jìn)行了SDS-PAGE分析。電泳結(jié)果如圖6示。

圖6 SPI及SPI-D糖基化蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.6 SDS-PAGE analysis of SPI and SPI-D conjugates

圖譜顯示，改性后，糖基化蛋白的電泳譜帶相對(duì)于SPI的譜帶來(lái)說，分子質(zhì)量大于31000的蛋白條帶基本消失，而在分離膠頂端出現(xiàn)了明顯的高分子量的蛋白條帶，說明SPI中較大分子質(zhì)量的亞基與葡聚糖作用，形成分子量更大的糖基化蛋白。

3 結(jié)論

1）以乳化活性為指標(biāo)，確定大豆分離蛋白-葡聚糖干法改性最佳工藝條件為：反應(yīng)溫度70℃，反應(yīng)時(shí)間24 h，糖-蛋白質(zhì)量比為2∶1，乳化液的pH為8.0，此時(shí)糖基化蛋白的乳化活性為0.83，是其相同條件下對(duì)照樣的1.66倍。

2）以乳化穩(wěn)定性為指標(biāo)，確定大豆分離蛋白-葡聚糖干法改性最佳工藝條件為：糖-蛋白（3∶1），反應(yīng)時(shí)間24 h，反應(yīng)溫度70℃，乳化液的pH 8.0，此時(shí)糖基化蛋白的乳化穩(wěn)定性為59.28，是其相同條件下對(duì)照樣的2.06倍。

3）SDS-PAGE結(jié)果證實(shí)大豆分離蛋白經(jīng)干法糖基化改性生成了糖基化蛋白。

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