小葉女貞葉片提取物藥用活性研究

倪建成，呂述權(quán)，丁 驍，譚慶偉

(1．福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350002;2．福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所，福建福州350002)

小葉女貞(Ligustrum quihoui Carr．)又名小白蠟，為木犀科(Oleaceae)女貞屬(Ligustrum)植物，主要分布于我國(guó)華北、華中和西南地區(qū)。其葉入藥，具清熱解毒等功效，治燙傷、外傷，樹皮入藥治燙傷。近年來的研究表明，小葉女貞提取物具有顯著的增強(qiáng)機(jī)體免疫力、止咳平喘及清除自由基等作用(韓兆東等，2008;邱世翠等，2003;楊肇亨等，1996;徐向田，2009;洪新，1995)。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

小葉女貞葉采自福建農(nóng)林大學(xué)校園，經(jīng)福建農(nóng)林大學(xué)植保學(xué)院歐陽(yáng)明安研究員鑒定;銅綠假單胞菌PAO1由中科院城市環(huán)境研究所饋贈(zèng);人肝癌細(xì)胞系BEL-7404由福建協(xié)和醫(yī)院肝膽研究所提供。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 小葉女貞葉片提取物的制備及初步分離 干燥小葉女貞葉片(5 kg)，采用煎煮法，煮沸30 min，取煎煮液合并，減壓濃縮得到粗提物。將粗提物用適量水溶解，采用大孔吸附樹脂D101除糖后，通過干柱層析(100-200目硅膠，氯仿/甲醇/水=8:2:0．2)，TLC檢測(cè)合并相同流分得到 Fr．1-Fr．6 共 6 個(gè)組分。

1．2．2 抗菌活性檢測(cè) 將小葉女貞葉片提取物用MH培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的供試溶液，過濾除菌后，4℃密封保存，備用。采用微量肉湯稀釋法，參考NCCLS抗菌藥物敏感性試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)小葉女貞葉提取物抗菌活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。以在孵育24 h和48 h小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度分別為MIC和MBC。

1．2．3 體外細(xì)胞毒性測(cè)定 采用MTT法(Twentyman PR et al．，1989)測(cè)定樣品對(duì)人肝癌細(xì)胞系BEL-7404增殖的抑制作用。將小葉女貞葉片提取物用細(xì)胞培養(yǎng)液配制成不同濃度的溶液，每樣品6個(gè)重復(fù)，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照(5-Fu，50 g/mL)，陰性對(duì)照(單細(xì)胞懸液)和空白對(duì)照(細(xì)胞培養(yǎng)液)。用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm波長(zhǎng)下吸光值，并計(jì)算抑制率，參照如下公式:

抑制率%=［1-(OD處理-OD空白)/(OD對(duì)照-OD空白)］×100

其中OD處理為處理組吸光度的平均值;OD對(duì)照為陰性對(duì)照組吸光度平均值;OD空白為空白對(duì)照組吸光度平均值。

1．2．4 DPPH自由基清除作用的檢測(cè) DPPH自由基是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，其乙醇水溶液呈很深的藍(lán)紫色，在517 nm處有強(qiáng)吸收，其顏色的變化隨被清除的程度而變化，通過測(cè)量517 nm處的吸光度可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)DPPH自由基被清除的效果。

根據(jù) Jamila等方法(Jamila HS et al．，2011)，稱取3．9 mg DPPH，加入100 mL無(wú)水乙醇配成0．1 M DPPH溶液;取潔凈的并作避光處理的10 mL離心管，樣品組加入1 mL不同濃度的樣品溶液和1 mL的DPPH溶液，陰性對(duì)照為2 mL的DPPH溶液，空白對(duì)照為2 mL的含樣品溶劑，以相同體積的抗壞血酸(VC)溶液代替待測(cè)樣品陽(yáng)性對(duì)照組，每樣品6次重復(fù);將離心管置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱避光振蕩，然后通過酶標(biāo)儀測(cè)定517 nm處的吸光度。

DPPH清除率%=(1-OD處理/OD空白)×100

其中OD處理為不同濃度各組分處理吸光度的平均值;OD對(duì)照為陰性對(duì)照組吸光度的平均值;OD空白為空白對(duì)照組吸光度的平均值。

2 結(jié)果與分析

2．1 抗菌活性

小葉女貞對(duì)銅綠假單胞菌PAO1有一定的抑制作用，12 h內(nèi)，5 mg/mL即可抑制其生長(zhǎng);24 h后，8 mg/mL濃度時(shí)，肉眼可見沒有細(xì)菌的生長(zhǎng)，可表明小葉女貞對(duì)銅綠假單胞菌PAO1的MIC為8 mg/mL。經(jīng)過36 h和48 h的培養(yǎng)后，9 mg/mL時(shí)，細(xì)菌的生長(zhǎng)繼續(xù)受到抑制，由此可以得出，小葉女貞粗提物溶液的MBC為9 mg/mL。

對(duì)小葉女貞葉片提取物初步分離得到的各組分Fr．1-Fr．6進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)，結(jié)果(表1)表明，培養(yǎng)12 h，2 mg/mL濃度處理下，F(xiàn)r．1表現(xiàn)出抑菌活性，其余部分都有菌生長(zhǎng);培養(yǎng)24 h，F(xiàn)r．1 在4 mg/mL 時(shí)有抑菌活性，MIC 為4 mg/mL;培養(yǎng)36 h，F(xiàn)r．1 在6 mg/mL 表現(xiàn)出抑菌活性，其余部分都喪失抑菌活性;培養(yǎng)48 h，F(xiàn)r．1在6 mg/mL仍表現(xiàn)出抑菌活性。由此確定了小葉女貞對(duì)銅綠假單胞菌PAO1的抑制活性組分為低極性組分Fr．1。

2．2 抗腫瘤活性

采用MTT法測(cè)試小葉女貞葉粗提物和以及初步分離得到的6個(gè)組分 Fr．1-Fr．6 對(duì)人肝癌細(xì)胞 BEL-7404細(xì)胞毒活性。結(jié)果(圖1)表明，粗提物對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7404體外增殖具有明顯的抑制作用，供試濃度0．6 mg/mL時(shí)，抑制率仍達(dá)到94．2%，但在 0．4 mg/mL 劑量下抑制效果減弱，抑制率為62．9%。

表1 小葉女貞提取物各組分對(duì)銅綠假單胞菌PAO1抑菌作用Table 1 Antibacterial effect of Fr．1-Fr．6 against PAO1

Fr．1 顯示出較高的活性(圖2)，在 0．4 mg/mL 劑量下，抑制率為91．3%，在0．2 mg/mL 劑量作用下，抑制率仍達(dá)到87．8%，同等條件作用下，陽(yáng)性對(duì)照(50 μg/mL的5＇-Fu)抑制率為95．1%。上述結(jié)果顯示，小葉女貞葉片提取物具有顯著的抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性，對(duì)其活性組分有必要進(jìn)一步研究。

圖1 小葉女貞葉片粗提物細(xì)胞毒活性(BEL-7404)Figure 1 Cytotoxicity of aqueous extract of Ligustrum quihoui leaves

圖2 小葉女貞不同組分細(xì)胞毒活性(BEL-7404)Figure 2 Cytotoxicity of Fr．1-Fr．6 against BEL-7404

2．3 抗氧化活性

設(shè)置濃度梯度，分別測(cè)定VC、小葉女貞粗提物及各部分對(duì)DPPH自由基的體外清除作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖3)小葉女貞粗提物具有較高的DPPH自由基清除能力，同陽(yáng)性對(duì)照VC相比，小葉女貞粗提物清除率略低于 VC，但隨著濃度的增加，兩者清除率幾乎相當(dāng)，在500 μg/mL時(shí)，清除率在96%左右(VC為96．6%，小葉女貞葉片提取物為95．4%)。

干柱層析得到的小葉女貞各組分對(duì)DPPH自由基仍保持較高的清除活性(圖4)，在250 μg/mL時(shí)，F(xiàn)r．1、Fr．2、Fr．3、Fr．5、Fr．6 清除率分別 89．5% 、88．9% 、92．7% 、92．9% 、93．6%;在 50 μg/mL時(shí)，F(xiàn)r．1、Fr．2、Fr．3、Fr．5、Fr．6 清除率分別 87．3% 、84．3% 、88．1% 、85．0% 、32．5% ，除了Fr．6清除率下降之外，其他組分基本上與同濃度的粗提物相當(dāng)。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)以及上述結(jié)果可推測(cè)，小葉女貞對(duì)DPPH自由基具有清除作用的活性物質(zhì)為多種化合物，一種可能是不同結(jié)構(gòu)類型的化合物，另一種是同種結(jié)構(gòu)類型的不同衍生物，并且相互之間可能會(huì)有相互協(xié)同作用。

圖3 小葉女貞粗提物和VC清除DPPH自由基作用Figure 3 DPPH free radical scavenging activity of VCand leave extract from Ligustrum quihoui

圖4 小葉女貞不同組分對(duì)DPPH自由基清除能力Figure 4 DPPH free radical scavenging activity of Fr．1-Fr．6

3 小結(jié)與討論

女貞屬植物作為中藥應(yīng)用已有2000年的歷史，實(shí)載于《神農(nóng)本草經(jīng)》我國(guó)民間常采其鮮嫩枝葉搗爛敷于傷口上，以防止感染。現(xiàn)代諸多研究發(fā)現(xiàn)，女貞屬植物多種次生代謝產(chǎn)物具有不同的藥用活性，如齊墩果酸、熊果酸(三萜類化合物)具有抗腫瘤活性，橄欖苦甙等具有利尿作用，一些裂環(huán)環(huán)烯醚萜類和黃酮類具有抗氧化活性。

本研究證實(shí)小葉女貞葉片提取物具有抗菌、抗腫瘤以及抗氧化作用，有必要對(duì)其活性成分進(jìn)行分離鑒定;并且通過對(duì)粗提物粗分和活性跟蹤測(cè)試初步確定了小葉女貞的藥理活性組分，這為我們進(jìn)一步研究其活性成分提供了依據(jù)。

韓兆東，阮月芹，宋月雁，侯佃臻，孫豐潤(rùn)，孔祥華．2008．小葉女貞對(duì)免疫功能損傷小鼠T淋巴細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用．濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，31(4):258-261．

洪新，楊肇亨，周向東．1995．小葉女貞提取物-M2自由基清除劑作用的實(shí)驗(yàn)研究．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，17(4):341-342．

邱世翠，孫豐潤(rùn)，韓兆東，張群，王志強(qiáng)．2003．小葉女貞對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞增殖和IL-1的影響．中國(guó)中醫(yī)藥科技，10(4):230-231．

徐向田．2009．復(fù)方小葉女貞茶調(diào)節(jié)大鼠血脂和影響動(dòng)物體重實(shí)驗(yàn)研究．中華中醫(yī)藥學(xué)刊，27(8):1749-1750．

楊肇亨，周向東，洪新，段緒偉，謝義霞，王志強(qiáng)．1996．靜脈注射小葉女貞提取物M2對(duì)67例慢性阻塞性肺疾患患者的止咳、平喘作用分析．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，18(2):138-139．

Jamila HS，Isabelle C，Christelle HS，Cédric P，Michel F，Catherine H．2011．Biological activities of flavonoids from Nitraria retusa(Forssk．)Asch．a(chǎn)nd their acylated derivatives．Food Chemistry，124:486-494．

Twentyman PR，F(xiàn)ox NE，Rees JK．1989．Chemosensitivity testing of fresh leukemia cells using the MTT colorimetric assay．British Journal of Haematology，71:19-22．