番茄紅素對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用

顏林淋 劉廠輝

番茄紅素對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用

顏林淋 劉廠輝

目的 探討番茄紅素對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)損傷的保護(hù)作用。方法 體外培養(yǎng)HUVEC，用0、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的TNF-α與HUVEC共同孵育30min，乳酸脫氫酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TNF-α處理對(duì)HUVEC的毒性作用。選取TNF-α干預(yù)對(duì)HUVEC細(xì)胞造成損傷的最佳濃度，并在處理前加入不同濃度的番茄紅素作用1h，WST-1實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HUVEC的增殖情況。結(jié)果 10 ng/mL TNF-α與細(xì)胞共同孵育30min后，對(duì)細(xì)胞造成的毒性作用最明顯。當(dāng)HUVEC預(yù)先與5μmol/L 番茄紅素孵育后，能顯著降低TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。結(jié)論 番茄紅素能顯著降低TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，這可能是番茄紅素防治一些炎癥相關(guān)性疾病的機(jī)制之一。

番茄紅素；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；TNF-α

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)引起的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是威脅人類(lèi)健康最常見(jiàn)的疾病之一，其發(fā)病率和死亡率居各類(lèi)心血管疾病首位[1]。研究證明AS斑塊形成與血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及功能損傷有著密切關(guān)系，而內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動(dòng)脈粥樣硬化形成早期病變的始動(dòng)環(huán)節(jié)[2]。因此探討并研究具有內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的生物活性藥物，對(duì)防治冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病具有重要的意義。本研究旨在觀察番茄紅素對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的影響，以進(jìn)一步以了解其細(xì)胞保護(hù)作用。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑 HUVEC細(xì)胞株購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)細(xì)胞典藏中心；RPMI 1640培養(yǎng)基為Invitrogen產(chǎn)品。新生牛血清購(gòu)自杭州四季青公司。番茄紅素試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMSO購(gòu)自上海生物工程有限公司。WST-1細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒為江蘇碧云天公司產(chǎn)品，CytoTox 96非放射性細(xì)胞毒性分析試劑盒購(gòu)自Promega。細(xì)胞培板為Corning產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 HUVEC用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在37℃、含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶后消化傳代，在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，立即傾去胰蛋白酶，加適量含血清的培養(yǎng)基吹打成單細(xì)胞懸液，用含血清的1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度后轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)，使其12～24h內(nèi)細(xì)胞密度達(dá)到約90%以上，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖褂谩?/p>

1.3 乳酸脫氫酶檢測(cè) 用消化液消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，100μL/孔。待細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)，加入不同濃度的TNF-α（0ng/mL、5ng/ mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL和80 ng/mL）孵育30min。采用CytoTox 96非放射性細(xì)胞毒性分析試劑盒檢測(cè)LDH的釋放情況，檢測(cè)波長(zhǎng)為450nm。

1.4 WST-1實(shí)驗(yàn) 選取上述TNF-α干預(yù)HUVEC細(xì)胞造成損傷的最佳濃度，并在處理前先加入不同濃度的番茄紅素作用1h。實(shí)驗(yàn)終止前每孔加入WST-1100μL繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄培養(yǎng)液，酶標(biāo)儀上測(cè)定570nm波長(zhǎng)下的吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。其計(jì)算公式為：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（1-試驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度）×100%。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度TNF-α對(duì)HUVEC細(xì)胞毒性的影響 用0ng/L、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL和40ng/mL TNF-α作用于HUVEC后，LDH漏出實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著TNF-α濃度的增加，LDH釋放逐漸增多。見(jiàn)表1所示。

表1 不同濃度TNF-α對(duì)HUVEC細(xì)胞的毒性作用

表2 不同濃度番茄紅素對(duì)損傷的HUVEC保護(hù)作用

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞是襯貼于血管內(nèi)的單層扁平細(xì)胞，除了構(gòu)成血管的重要屏障外，它還具有重要的生理功能，包括產(chǎn)生和釋放各種血管活性物質(zhì)，從而在維持血管的完整性以及調(diào)節(jié)血管張力等方面起著重要作用。同時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞也是各種內(nèi)外源性損傷因素作用的部位，也是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的始動(dòng)原因之一[3]。本研究選擇的HUVEC是研究?jī)?nèi)皮功能的常用細(xì)胞。而TNF-α作為一種炎性細(xì)胞因子，不但能引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，而且是啟動(dòng)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致AS發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要因素。本研究也發(fā)現(xiàn)，隨著TNF-α濃度的增高，HUVEC產(chǎn)生的LDH逐漸增高，表明TNF-α對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有直接毒性作用，因此本研究用TNF-α來(lái)建立內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型。

番茄紅素是一種類(lèi)胡蘿卜素，人血漿番茄紅素濃度為0.2～5μmol/L。番茄紅素作為一種天然色素廣泛存在于番茄、胡蘿卜、西瓜和番石榴等蔬菜和瓜果中?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，番茄紅素具有多種生理功能，包括抗氧化、清除自由基、預(yù)防腫瘤和心血管疾病以及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等作用[4]。除了上述功能外，也有研究發(fā)現(xiàn)番茄紅素具有一定的抗炎作用[5]，但是否能對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用尚不清楚。本研究擬通過(guò)采用TNF-α建立內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，結(jié)果表明，隨著番茄紅素濃度的增加，TNF-α所誘導(dǎo)的細(xì)胞抑制功能逐漸減弱，當(dāng)番茄紅素濃度達(dá)10μmol/L時(shí)，TNF-α的抑制作用僅為4.2%，這表明番茄紅素能在一定程度上起到預(yù)防內(nèi)皮細(xì)胞損傷作用。

目前臨床上治療AS主要采用他汀類(lèi)藥物[6]。本研究提出采用番茄紅素治療TNF-α誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，是一種有效的補(bǔ)充治療方案。由于番茄紅素來(lái)源于日常食用植物，因此具有副作用小，使用安全等優(yōu)點(diǎn)，具有廣大的應(yīng)用前景。這有望為臨床治療提供更多的選擇。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2012.26.019

421001 南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科 （顏林淋 劉廠輝） 432000 湘南學(xué)院附屬醫(yī)院（顏林淋）