蛇床子素β-環(huán)糊精包合物的制備及穩(wěn)定性考察

王周麗，貝永燕，顧宗林，朱愛軍，陳維良，施林森，張學(xué)農(nóng)

（蘇州大學(xué)藥學(xué)院藥學(xué)系，江蘇蘇州215123）

蛇床子素β-環(huán)糊精包合物的制備及穩(wěn)定性考察

王周麗＊，貝永燕，顧宗林，朱愛軍，陳維良，施林森，張學(xué)農(nóng)#

（蘇州大學(xué)藥學(xué)院藥學(xué)系，江蘇蘇州215123）

目的：制備蛇床子素β-環(huán)糊精包合物，并考察其穩(wěn)定性。方法：采用逆向混合攪拌法制備蛇床子素β-環(huán)糊精包合物，用紫外分光光度法測定包合物中蛇床子素的含量、溶解度、溶出度；以蛇床子素含量為考察指標(biāo)，對蛇床子素β-環(huán)糊精包合物進行強光照射、高溫和高濕試驗。結(jié)果：經(jīng)顯微鏡觀察、紫外光譜、熱分析等方法證明包合物確已形成，包合物的溶解度約是原藥的34倍，120 min時包合物的累積溶出量約是原藥的2.5倍。在光、熱、濕等因素影響下，包合物中蛇床子素含量沒有明顯變化，而蛇床子素與β-環(huán)糊精物理混合物的含量明顯下降。結(jié)論：包合物能顯著改善蛇床子素的溶解度和溶出度，蛇床子素β-環(huán)糊精包合物具有較好的抗光照性、熱穩(wěn)定性和濕穩(wěn)定性，其穩(wěn)定性明顯優(yōu)于蛇床子素混合物。

蛇床子素；β-環(huán)糊精包合物；紫外分光光度法；溶解度；溶出度；穩(wěn)定性

蛇床子素又名甲氧基歐芹酚，是從傘形科蛇床子屬植物蛇床Cnidium monnieri（L.）Cuss.的果實中提取的一種香豆素類化合物[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，蛇床子素具有抗高血壓、抗心律失常、抗脂肪肝、抗腫瘤[2]、抗骨質(zhì)疏松癥等功效。近年來，蛇床子素已有內(nèi)服和外用制劑用于臨床，但由于蛇床子素難溶于水[3]，口服生物利用度低[4]，口感麻辣，口服后對胃有燒灼感，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，見光易分解[5]，故限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。本研究以β-環(huán)糊精（β-CD）為載體[6]，制備蛇床子素β-CD包合物（以下簡稱包合物），以增加蛇床子素的水溶性，提高穩(wěn)定性，掩蓋其麻辣味，并加快藥物的溶出速率，以便進一步制備口服給藥新劑型。

1 儀器與試藥

ME2155分析天平（德國Starorious公司）；85-2A恒溫磁力攪拌器（金壇市富華儀器有限公司）；旋蒸儀（鞏義市英峪與華儀器廠）；UV-2401pc紫外分光光度計（日本島津公司）；RCZ-6B2藥物溶出度儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）；KQ3200B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

蛇床子素原料藥（南京藥物研究所植化室，純度：99%）；β-CD（郁南縣永光環(huán)糊精有限公司，純度：99%）；無水乙醇（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；水為蒸餾水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 包合物的制備

采用逆向混合攪拌法[7]，主客分子比為1∶1（m/m）制備。即稱取蛇床子素0.244 g溶于20 mL無水乙醇中，于恒溫磁力攪拌器上，固定轉(zhuǎn)速800 r·min－1，50℃攪拌至全溶為A液；將1.135 gβ-CD溶于30 mL蒸餾水中，同溫攪拌至全溶為B液。將B液分2次緩緩滴加入A液中，間隔15～20 min，加蓋攪拌3 h，取蓋攪拌3 h，揮散乙醇，使溶液濃縮至約30 mL，置冰箱中冷藏24 h，抽濾。沉淀物依次用少量蒸餾水和乙酸乙酯快速洗去β-CD和未包合的蛇床子素后，低溫（約40℃）避光干燥，即得。整個試驗過程需避光。

2.2 蛇床子素含量測定

2.2.1 測定波長的選擇 精密稱取蛇床子素10 mg，置于50 mL量瓶中，用50%乙醇定容，配成200μg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)母液。以50%乙醇為空白對照，在紫外分光光度計200～400 nm波長范圍內(nèi)對蛇床子素進行掃描。結(jié)果顯示，蛇床子素在322 nm波長處有最大吸收峰，而β-CD在200～400 nm波長范圍沒有吸收峰，故選擇322 nm為蛇床子素的檢測波長。紫外吸收光譜見圖1。

圖1 紫外吸收光譜A.蛇床子素；B.β-環(huán)糊精Fig 1 UV absorption spectrumA.osthol；B.β-CD

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)母液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，置于10 mL量瓶中，用50%乙醇定容，制備成不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以50%乙醇作為空白對照，在322 nm波長處測定吸光度。以蛇床子素檢測濃度（c）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，得回歸方程為A＝0.073 5 c－0.000 4（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，蛇床子素檢測濃度在2～24μg·mL－1范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.2.3 加樣回收率試驗 精密量取蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.6、1.2 mL，置于10mL量瓶中，加入適量β-CD，混勻，加50%乙醇至全量，濾過，取續(xù)濾液，按“2.2.1”項下方法測定，計算加樣回收率。結(jié)果，平均回收率為99.73%，RSD＝0.78%（n＝6）。

2.2.4 精密度試驗 精密量取蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.6、1.2 mL，置于10 mL量瓶中，加50%乙醇至全量，濾過，取續(xù)濾液，按“2.2.1”項下方法同日內(nèi)連續(xù)測定3次，計算日內(nèi)精密度；連續(xù)測定3 d，計算日間精密度。結(jié)果，日內(nèi)精密度的RSD分別為1.46%、0.54%、0.15%（n＝3）；日間精密度的RSD分別為0.89%、0.47%、0.16%（n＝3），表明儀器精密度良好。

2.3 包合物中蛇床子素的含量測定

精密稱取包合物100 mg，用50%乙醇定容至50 mL量瓶，濾過，取續(xù)濾液4 mL，用50%乙醇稀釋于50 mL量瓶中，于322 nm波長處測定吸光度，根據(jù)“2.2.2”項下回歸方程計算得包合物中藥物平均含量為（0.12±0.03）g，蛇床子素包合率為（12.54±0.25）%（包合率＝包合物中蛇床子素含量/包合物重量×100%）。

2.4 包合物溶解度測定

分別制備蛇床子素和包合物的飽和水溶液，濾過，取續(xù)濾液1.0 mL，用50%乙醇定容于25 mL量瓶中，搖勻，在322 nm波長處測定吸光度，根據(jù)“2.2.2”項下回歸方程分別計算得蛇床子素溶解度為（2.33±0.24）μg·mL－1（n＝3），包合物溶解度為（79.18±0.29）μg·mL－1（n＝3）。結(jié)果表明，包合物中蛇床子素的溶解度增加了約34倍。

2.5 包合物溶出度測定

經(jīng)反復(fù)試驗，采用含0.2%十二烷基硫酸鈉的人工胃液作溶出介質(zhì)效果較好。按“2.2.2”項下方法操作，得到含0.2%十二烷基硫酸鈉人工胃液為溶媒的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A＝0.072 5c－0.004 6（r＝0.999 7），其平均回收率為99.32%，RSD＝1.23%（n＝6）。

分別精密稱取蛇床子素約10 mg和相當(dāng)含量的包合物與蛇床子素與β-CD物理混合物（以下簡稱物理混合物）各3份，放入膠囊中，以含0.2%十二烷基硫酸鈉的人工胃液900 mL作溶出介質(zhì)，采用轉(zhuǎn)籃法，轉(zhuǎn)速為100 r·min－1，溫度為（37±0.5）℃，分別在規(guī)定時間吸取介質(zhì)10 mL（同時補充同溫等量介質(zhì)），經(jīng)0.8μm微孔濾膜濾過。以溶出介質(zhì)為空白，在322 nm波長處測定吸光度，求得溶出量，計算各個時間點的平均累積溶出度，繪制溶出曲線（見圖2）。結(jié)果，包合物體外溶出明顯加快，120 min時包合物的累積溶出量約是原藥的2.5倍，表明蛇床子素與包合物中蛇床子素的溶出度有顯著性差異（P＜0.05）。

圖2 溶出曲線Fig 2 Dissolution curve

2.6 包合物的鑒定

2.6.1 顯微鏡法 分別將β-CD、蛇床子素、包合物和物理混合物置顯微鏡下（100倍）觀察，可見β-CD為大而透明的白色柱狀結(jié)晶，蛇床子素為粉狀小粒，物理混合物中2種晶型都存在，而包合物的晶型與大小已發(fā)生了改變，證明蛇床子素和β-CD形成了包合物。

2.6.2 紫外光譜法 分別制備β-CD、蛇床子素、包合物的50%乙醇溶液，濾過，取續(xù)濾液。紫外掃描結(jié)果表明，β-CD在200～400 nm波長范圍無吸收，蛇床子素和包合物的紫外掃描圖譜基本一致。再分別制備3種物質(zhì)的水溶液，濾過，取續(xù)濾液進行紫外掃描。結(jié)果，β-CD的水溶液無吸收，蛇床子素不溶于水，在紫外區(qū)無吸收，而包合物溶于水，在紫外區(qū)有吸收峰，且與50%乙醇中的掃描圖譜一致。

2.6.3 熱分析法 對包合物、物理混合物、β-CD和蛇床子素這4種樣品進行差熱分析，升溫速率為10℃·min－1，升溫范圍為30～500℃，測定氣體為空氣。結(jié)果，包合物與蛇床子素、物理混合物的圖譜有明顯的差異，在圖上曲線c中，223.90℃（蛇床子素熔點）無明顯吸熱峰，放熱峰明顯后移，說明β-CD已基本包合蛇床子素，且提高了藥物的耐熱分解性能；對于物理混合物的曲線d，基本上是曲線a和b的疊加。差示掃描量熱分析見圖3。

圖3 差式掃描量熱分析a.β-環(huán)糊精；b.蛇床子素；c.包合物；d.物理混合物Fig 3 Analysisof differential scanning calorimetry analysisa.β-CD；b.osthol；c.inclusion complex；d.physical mixture

2.6.4 紅外光譜法 用KBr將包合物、物理混合物、β-CD和蛇床子素壓片，分別測定。結(jié)果，蛇床子素的紅外曲線（d）中存在大量的尖峰，較為特征的就是1 720.49 cm－1和1 604.77 cm－1處的2個尖峰，這2個尖峰在物理混合物中也有體現(xiàn)，而在包合物中，尖峰消失，說明β-CD已基本包合了蛇床子素；經(jīng)包合后，β-CD在1 635.63 cm－1處的峰紅移至了1712.91 cm－1處，這說明包合作用不僅僅是簡單的物理混合，而是生成了新的物相；而物理混合物的曲線（c），基本上是曲線a和d的疊加。紅外吸收光譜見圖4。

2.6.5 X-射線衍射法 它是一種鑒定晶體化合物的常用技術(shù)，各晶體物質(zhì)在相同的角度處具有不同的晶面間距，從而顯示不同的衍射峰。圖中c為β-CD和蛇床子素的物理混合物，主要峰為兩種物質(zhì)的疊加；d為包合物，其中21.49°和26.01°峰已消失，而在10.68°和26.75°出現(xiàn)新的峰，這些峰在蛇床子素和β-CD中均不存在，表明已形成了新的物相。X-射線衍射分析見圖5。

2.7 包合物穩(wěn)定性考察

將供試品置培養(yǎng)皿中，攤成≤5mm厚的薄層，進行以下試驗。

2.7.1 光照試驗 分別取包合物和物理混合物置于培養(yǎng)皿中，在照度為（4 500±500）lx的光照試驗箱中照射10 d，于第0、5、10天取樣測定蛇床子素含量。結(jié)果，包合物在光照條件下較穩(wěn)定，光照10 d損失率為4.46%；混合物光照10 d損失率達(dá)20.97%，表明包合物的抗光解性明顯優(yōu)于物理混合物，詳見表1。

圖4 紅外吸收光譜a.β-環(huán)糊精；b.包合物；c.物理混合物；d.蛇床子素Fig 4 IR absorption spectruma.β-CD；b.inclusion complex；c.physical mixture；d.osthol

圖5 X-射線衍射分析a.β-環(huán)糊精；b.蛇床子素；c.物理混合物；d.包合物Fig 5 Analysis of X-ray diffractiona.β-CD；b.osthol；c.physical mixture；d.inclusion complex

2.7.2 高溫試驗 分別取包合物和物理混合物置于培養(yǎng)皿中，在60℃恒溫干燥箱內(nèi)放置10 d，于第0、5、10天取樣測定蛇床子素含量。結(jié)果，包合物在高熱條件下較穩(wěn)定，在60℃放置10 d損失率分別為3.66%、6.52%；物理混合物在相同條件下?lián)p失率分別為15.32%、24.14%，表明蛇床子素的熱穩(wěn)定性較差，而經(jīng)包合后的蛇床子素穩(wěn)定性顯著提高，詳見表1。

2.7.3 高濕試驗 分別取包合物和物理混合物置恒濕密閉容器中，在25℃于（飽和NaCl溶液中）相對濕度為（90%±5%）條件下放置10 d，于第0、5、10天取樣測定蛇床子素含量。結(jié)果，在高濕條件下，包合物較物理混合物穩(wěn)定，詳見表1。

表1 穩(wěn)定性試驗結(jié)果（n＝3）Tab 1 Results of stability tests（n＝3）

3 討論

蛇床子素在水中難溶，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，見光易分解，在制劑過程中，先將其制成水溶性的β-CD包合物，可提高其穩(wěn)定性，這對于最大限度地發(fā)揮其療效具有重要的意義。本研究采用逆向攪拌法，滴加過程雖有少量β-CD析出，但隨著水相的增加，溶液很快澄明，與常規(guī)的制備方法相比[8]，既提高了包合物的收率和包合率，又有較好的工藝穩(wěn)定性。采用紫外分光光度法測定包合物中蛇床子素的含量時，包合材料β-CD對蛇床子素的測定無影響，該方法在2～24μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，是一種簡便、經(jīng)濟、快捷、穩(wěn)定的測定方法。包合物經(jīng)X-射線衍射法、紅外光譜法和差熱分析法鑒定，蛇床子素與β-CD已形成一種新的物相，包合物確已形成。穩(wěn)定性試驗表明，包合物的抗光解性、熱穩(wěn)定性和濕穩(wěn)定性明顯高于物理混合物。可見，蛇床子素經(jīng)β-CD包合后，對光、熱和濕的穩(wěn)定性顯著提高。

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Preparation and Stability Study of Osthol-β-CD Inclusion Complex

WANG Zhou-li，BEI Yong-yan，GU Zong-lin，ZHU Ai-jun，CHEN Wei-liang，SHI Lin-sen，ZHANG Xue-nong
（School of Pharmacy，Soochow University，Jiangsu Suzhou 215123，China）

OBJECTIVE：To prepare the inclusion complex of osthol-β-cyclodextrin（osthol-β-CD），and to investigate the stability of inclusion complex.METHODS：The inclusion complex of osthol-β-CD was prepared by counter mixture stirring method.The content，solubility and dissolution of osthol in inclusion complex were determined by UV spectrophotometry.Using the content of osthol as the inspection index，the inclusion complex of osthol-β-CD was examined with intense light，high temperature and humidity test.RESULTS：The formation of the inclusion complex was confirmed by microscope examination，UV absorption spectrum scanning，thermal analysis，etc.The solubility of inclusion complex increased about 34 times.The accumulative dissolving quantity of inclusion complex was about 2.5 times the drug substance within 120 min.The content of osthol showed no significant changes in the inclusion compounds but noticeable changes in the physical mixture of osthol and β-cyclodextrin.CONCLUSION：The results indicate that the inclusion complex can improve the solubility and dissolution of osthol.Osthol-β-CD has the characteristics of anti-light，anti-heat and anti-humidity，and the stability of it is better than that of osthol mixture.

Osthol；β-cyclodextrin inclusion complex；UV spectrophotometry；Solubility；Dissolution；Stability

R969.1；R971.1

A

1001-0408（2012）39-3686-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.39.14

2011-10-19

2012-03-02）

Δ國家自然科學(xué)基金資助項目（81001673）；陜西省“13115”科技創(chuàng)新工程重大科技專項項目（2010ZDKG-62）；陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃項目（2010JQ4018）

＊碩士研究生。研究方向：中草藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。電話：029-84775475-8004。E-mail：cuijia2008@163.com

#a通訊作者：副主任藥師，博士。研究方向：藥劑學(xué)、藥理學(xué)。電話：029-84775475-8004。E-mail：handsomfish@yahoo.com.cn

#b通訊作者：主任藥師，博士。研究方向：臨床藥學(xué)與臨床藥理學(xué)。電話：029-84773636。E-mail：adwen@fmmu.edu.cn