雙酶法制備螺旋藻多肽的工藝研究

孫宜君，常 蓉，張 嬌，劉士偉，李博生

1北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院;2北京林業(yè)大學(xué)螺旋藻研究所，北京100083

雙酶法制備螺旋藻多肽的工藝研究

孫宜君1，常 蓉1，張 嬌1，劉士偉1，李博生2*

1北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院;2北京林業(yè)大學(xué)螺旋藻研究所，北京100083

選用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶結(jié)合的雙酶法對螺旋藻蛋白進行水解。其中，對木瓜蛋白酶水解螺旋藻蛋白的工藝進行優(yōu)化。以水解度為指標(biāo)，研究了酶解時間、酶與底物比、pH和酶解溫度4種因素對酶解反應(yīng)的影響。在此基礎(chǔ)上設(shè)計了3因素(加酶量、酶解溫度和pH)3水平的響應(yīng)面試驗。結(jié)果表明堿性蛋白酶水解螺旋藻蛋白的最佳酶解條件為:加酶量4300 U/g，pH 7.0，酶解溫度55℃，酶解時間160 min;木瓜蛋白酶的最佳酶解條件為:酶底比為4.5%，酶解溫度60℃，pH 6.5，酶解時間210 min。利用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶結(jié)合的雙酶法制得的多肽水解度可達32.90%，與單酶法相比，水解度明顯提高。

螺旋藻肽;堿性蛋白酶;木瓜蛋白酶;水解條件

螺旋藻(Spirulina)是一類單細(xì)胞生物，屬于藍藻門顫藻科螺旋藻屬。其中，極大螺旋藻(S.Maxcima)和鈍頂螺旋藻(S.Platensis)是應(yīng)用于生產(chǎn)的主要藻種。螺旋藻富含營養(yǎng)，蛋白質(zhì)含量高達50%～70%，氨基酸組成比例合乎人體的需求，是一種極好的蛋白質(zhì)來源［1］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，人類攝取蛋白質(zhì)經(jīng)消化酶作用后，并非主要以氨基酸的形式吸收，而是以肽的形式吸收。一些多肽同時具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降血壓、抗菌等多種生理功能［2］。利用酶法水解制備生物活性肽已經(jīng)成為近年來研究的新熱點，其具有反應(yīng)條件溫和、專一性強、反應(yīng)進程容易控制和無不良副反應(yīng)等優(yōu)點［3］。對螺旋藻蛋白質(zhì)進行水解有利于提高蛋白質(zhì)的溶解性和吸收利用率，螺旋藻蛋白質(zhì)酶解后形成多肽及小分子肽，能被人體快速吸收［4］。本研究選用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶結(jié)合的雙酶法對螺旋藻蛋白進行水解，為提高螺旋藻中蛋白質(zhì)資源的利用效率、研究螺旋藻多肽生理活性奠定了基礎(chǔ)，對螺旋藻的綜合利用具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鈍頂螺旋藻粉Spirulina platensis(蛋白質(zhì)含量＞60%，水分＜7%)，由北京林業(yè)大學(xué)螺旋藻研究所提供;考馬斯亮藍G-250，AMRESCO公司出品;硫酸銨為分析純，北京化學(xué)試劑公司生產(chǎn);甲醛溶液為分析純，汕頭市西隴化工有限公司出品;堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶均為分析級，美國sigma公司生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

7-A2004型電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司制造;SHK-99-II型臺式空氣恒溫?fù)u床，北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司出品;DSY-2-8型電熱恒溫水浴鍋，北京國華醫(yī)療機械廠制造;GL-20G-II型冷凍離心機，上海安寧科學(xué)儀器廠生產(chǎn);LL-1500型真空冷凍干燥機，賽默飛世爾科技(中國)有限公司出品。

1.3 實驗方法

1.3.1 螺旋藻蛋白的制備

利用反復(fù)凍融結(jié)合超聲波法制備螺旋藻蛋白［5-6］。具體步驟為:將適量螺旋藻干粉以1∶10的比例加入蒸餾水制成螺旋藻懸浮液，超聲波細(xì)胞破碎儀超聲處理(功率700 W，超聲處理10 s，間隔10 s，共超聲處理20 min)。超聲處理后，用液氮將螺旋藻液冷凍，之后于37℃水浴中解凍，反復(fù)5次凍融后再重復(fù)超聲處理。收集螺旋藻溶液，4℃下8000 rpm離心20 min，收集上清液。上清液加入NH4SO4至50%飽和度，4℃下8000 rpm離心20 min，收集沉淀。以濃度0.005 M，pH6.86的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，4℃下于去離子水中透析，透析終點用BaCl2檢測予以確定，真空冷凍干燥得到螺旋藻蛋白。

1.3.2 螺旋藻蛋白的水解

先使用堿性蛋白酶水解螺旋藻蛋白，水解完畢后在85℃水浴中滅酶20 min，再按照木瓜蛋白的水解條件進一步水解。水解結(jié)束后于85℃水浴中滅酶20 min，4℃ 下8000 rpm離心20 min后，收集上清液冷凍干燥備用。

1.3.3 水解度的測定

采用甲醛滴定法。

2 結(jié)果與分析

2.1 單酶和雙酶水解螺旋藻蛋白對其水解度的影響

以水解度為指標(biāo)，對堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、雙酶法A(先加入木瓜蛋白酶再加入堿性蛋白酶)和雙酶法B(先加入堿性蛋白酶再加入木瓜蛋白酶)處理下螺旋藻蛋白的水解度大小進行比較實驗，結(jié)果如表1。

表1 不同酶處理下螺旋藻蛋白水解度大小的比較Table 1 Comparison of the degree of Spirulina protein hydrolysis under different enzyme treatment

由表1可看出，雙酶法B得到的蛋白水解度最高，這可能是由于兩種酶對對方水解產(chǎn)物的水解程度不同造成的。雙酶法B與其他三種方法相比，其水解度增加率如表2所示。

表2 水解度增加率Table 2 the incresing rate of DH

根據(jù)以上結(jié)果選擇雙酶法B(先加入堿性蛋白酶再加入木瓜蛋白酶)作為酶解方法進行實驗。

2.2 木瓜蛋白酶水解螺旋藻蛋白的工藝條件

根據(jù)文獻，選擇堿性蛋白酶的水解條件為:水解時間為160 min，溫度為55℃，pH為7.0，加酶量為4300 U/g［7］。

木瓜蛋白酶水解條件的確定實驗，使用底物為經(jīng)過堿性蛋白酶水解后的水解液，以此來觀察酶與底物比例、溫度(℃)、pH、時間(min)對水解度的變化情況。

2.2.1 酶與底物濃度的比例對水解程度的影響

選取水解時間為210 min，水解pH為6.5，水解溫度為60℃三個因素不變，分別選取酶與底物比例(E/S，W/W)為:2%、3%、4%、5%、6%進行水解實驗。結(jié)果見圖1。

圖1 酶底比對螺旋藻蛋白水解度的影響Fig.1 Effects of concentration of substrate on degree of hydrolysis

由圖1可知，在底物濃度一定的情況下，酶與底物比例為2%～5%時，隨著酶用量的增加，水解度在不斷上升，而酶與底物比例為5%～6%時，隨著酶用量的增加，水解度呈現(xiàn)下降趨勢。這可能是由于酶與底物接觸達到飽和，過多的酶之間相互抑制的原因。所以，再繼續(xù)添加水解酶，水解度將不再增加而出現(xiàn)下降的趨勢。因此，最適酶與底物比例是5%。

2.2.2 溫度對水解程度的影響

選取水解時間為210 min，水解pH為6.5，酶與底物比例為5%(E/S，W/W)三個因素不變，分別選取水解溫度為:50、55、60、65、70℃進行水解實驗。結(jié)果見圖2。

圖2 溫度對螺旋藻蛋白水解度的影響Fig.2 Effects of temperature on the degree of hydrolysis

由圖2可知，不同溫度對酶解過程影響較大，在水解溫度較低時，即50～60℃之間，隨著溫度的增加水解度也在增加，但當(dāng)溫度過高時，即60℃之后，水解度呈現(xiàn)較快的下降趨勢。這與溫度過高導(dǎo)致酶失活有關(guān)。因此，最適溫度為60℃。

2.2.3 pH值對水解程度的影響

選取水解時間為210 min，水解溫度為60℃，酶與底物比例為5%(E/S，W/W)三個因素不變，分別選取水解pH值為:5.5、6.0、6.5、7.0、7.5進行水解實驗。結(jié)果見圖3。

圖3 pH值對螺旋藻蛋白水解度的影響Fig.3 Effects of pH value on the degree of hydrolysis

由圖3可知，pH值過高或過低都會使水解效果下降。pH值在5.5～6.5之間時，水解度隨著pH值的升高而增加，而pH值在6.5～7.5之間時，水解度隨著pH值的升高而不斷下降。這與酶在過高或過低pH值時活力會下降有關(guān)。因此，最適pH值為6.5。

2.2.4 時間對水解程度的影響

選取水解pH為6.5，水解溫度為60℃，酶與底物比例為5%(E/S，W/W)三個因素不變，分別選取水解時間為:60、90、120、150、180、210、240、270 min進行水解實驗。結(jié)果見圖4。

圖4 時間對螺旋藻蛋白水解度的影響Fig.4 Effects of time on the degree of hydrolysis

由圖4中可知，隨著時間的延長，水解度也在不斷增加，當(dāng)水解時間達到210 min后水解度基本保持穩(wěn)定，不再升高。這可能是由于水解到一定程度后，底物減少和酶與酶之間形成競爭造成的。所以水解時間為210 min較為合適。

2.3 響應(yīng)面分析優(yōu)化水解工藝條件

2.3.1 響應(yīng)面分析法試驗設(shè)計及結(jié)果分析

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，采用Box-Behnken模型，以酶與底物比例A，水解溫度B，pH值三個因素為自變量，并以+1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平，對自變量進行編碼，水解度Y為響應(yīng)值。通過使用統(tǒng)計軟件Design-Expert對響應(yīng)曲面進行分析，同時對結(jié)果進行方差分析。響應(yīng)面分析因素及水平安排見表3。

表3 應(yīng)面分析因素及水平Table 3 Analytical factors and levels for RSA

綜合單因素實驗結(jié)果，選取了影響水解度大小的三個顯著因素即:酶底比、溫度、pH，按照Box-Behnken模型，利用統(tǒng)計軟件Design-Expert進行了三因素三水平的響應(yīng)面試驗設(shè)計，其試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表4:

運用Design-Expert軟件對表4中的響應(yīng)面試驗結(jié)果進行二次回歸分析，擬合得到回歸方程為:

Y=5.75+0.17×A+0.023×B+0.055×C-0.072×A×B-0.064×A×C+0.070×B×C-0.15× A2-0.17×B2-0.20×C2

為了檢驗方程的有效性，對雙酶法水解螺旋藻蛋白的數(shù)學(xué)模型進行了方差分析，分析結(jié)果見表5，模型系數(shù)顯著性檢驗見表5。

表4 試驗設(shè)計方案與結(jié)果Table 4 Program and experimental ental results of RSA

表5 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 5 ANOVA of the regression model of quadratic response surface

由表5可知，總的模型“Pr＞F”的值小于0.05，表明二次方程模型顯著。回歸方程的失擬項的檢驗P=0.6684＞0.05，不顯著，表明未知因素對試驗結(jié)果干擾很小，同時回歸方程的復(fù)相關(guān)系數(shù) R2= 0.9261，說明因變量與所有自變量之間的回歸關(guān)系顯著，表明該回歸方程與實際情況擬合的很好。這較好地反映了水解度與酶底比、溫度及pH值的關(guān)系，所以可以說該回歸方程能較好的預(yù)測木瓜蛋白酶水解螺旋藻蛋白的水解度隨這三個影響因素的變化規(guī)律。

表6 二次響應(yīng)面回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果Table 6 Test result of significance for the regression model of quadratic response surface

由表6可知，模型一次項A影響極顯著(P＜0.01);A2、B2、C2影響顯著(P＜0.05);一次項B、C和交互項AB、AC、BC影響均不顯著。即:酶與底物比例對水解度大小的影響極其顯著;酶與底物比例、溫度、pH的二次項對水解度大小的影響比較顯著;三個因素的交互項對木瓜蛋白酶水解螺旋藻蛋白水解度的大小影響不顯著。

2.3.2 響應(yīng)曲面的分析與優(yōu)化

為了更直觀的看出所有因素中的兩個因素同時對水解度的大小的影響，可令除了要觀察的兩項外的其它因素水平值為0，這樣可以得到兩個因素的交互影響的效果圖，經(jīng)過對得到的二元二次方程的分析，可以繪制出相應(yīng)的響應(yīng)面圖。見圖5、圖6和圖7。

圖5 溫度和酶底比對水解反應(yīng)交互作用影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surfaces for effects of enzyme dosage and hydrolysis temperature and their mutualinter action on degree of hydrolysis

由圖5所示，該響應(yīng)面開口向下，水解度先是隨著酶與底物比例和溫度的增加而升高，二者有較為明顯的交互作用，當(dāng)溫度和酶與底物比例達到一定數(shù)值后曲面趨于平緩。從整個曲面來看，水解度的變化隨著酶與底物比例的變化呈現(xiàn)的曲線較陡，而隨著溫度的變化呈現(xiàn)的曲線較平緩。這說明酶與底物比例的變化相對于溫度的變化來講，其對水解度的大小影響較為明顯。

圖6 pH值和酶底比對水解反應(yīng)交互作用影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surfaces for effects of enzyme dosage and reaction pH value and their mutualinter action on degree of hydrolysis

由圖6所示，該響應(yīng)面開口向下，水解度先是隨著酶與底物比例和pH值的增加而升高，二者有著較為明顯的交互作用，當(dāng)pH值和酶與底物比例達到一定數(shù)值后曲面變得趨于平緩。從整個曲面來看，水解度的變化隨著酶與底物比例的變化呈現(xiàn)的曲線較陡，而隨著pH值的變化呈現(xiàn)的曲線較為平緩。這說明酶與底物比例的變化相對于pH值的變化來講，其對水解度的大小影響較為明顯。

圖7 pH值和溫度對水解反應(yīng)交互作用影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surfaces for effects of reaction pH value and hydrolysis temperature and their mutualinter action on degree of hydrolysis

由圖7所示，該響應(yīng)面開口向下，水解度先隨著pH值和溫度的增加而升高，二者有著明顯的交互作用，當(dāng)pH值和溫度達到一定數(shù)值后曲面變得趨于平緩。從整個曲面來看，水解度的變化隨著pH值的變化和溫度的變化呈現(xiàn)的曲線都較為平緩。這說明pH值的變化和溫度的變化對水解度大小的影響程度均不是很明顯。

2.3.3 水解工藝條件的優(yōu)化和驗證

采用Box-Behnken模型進行響應(yīng)面設(shè)計得到回歸方程，再對該模型進行二次回歸分析，各因素對水解度的影響大小順序為:A＞C＞B，即依次為:E/S、pH值、溫度。由回歸方程計算得出木瓜蛋白酶水解螺旋藻蛋白的最佳工藝條件為:水解時間為210 min，溫度為59.80℃，pH值為6.52，酶與底物比例(E/S)為4.55%，理論可得水解度值為33.57%。

根據(jù)得到的最佳工藝條件數(shù)值進行取整處理，即:水解時間為210 min，溫度為60℃，pH值為6.5，酶與底物比例(E/S)為4.5%。按照調(diào)整后的工藝條件進行重復(fù)實驗得到實際水解度值為32.90%，比理論值低0.67%，說明該回歸模型具有較高的可靠性。

3 討論

酶解法生產(chǎn)多肽產(chǎn)品安全性高，生產(chǎn)條件溫和，易控制。李欣悅［8］通過不同蛋白酶對內(nèi)蒙古螺旋藻蛋白的酶解工藝優(yōu)化的研究，得出四種蛋白酶對螺旋藻的水解能力在各自的最適條件下依次是木瓜蛋白酶﹥堿性蛋白酶﹥胃蛋白酶﹥胰蛋白酶。木瓜蛋白酶水解螺旋藻時其水解度顯著高于其他三種，胰蛋白酶水解效果最差，這可能說明胰蛋白酶專一性強，水解位點少，而木瓜蛋白酶水解切割分解點多。王辰［9］等研究過木瓜蛋白酶對螺旋藻蛋白的水解作用，采用茚三酮比色法測定水解度。確定木瓜蛋白酶酶解螺旋藻蛋白的最適宜工藝參數(shù)為:溫度55℃，酶與底物比0.4%，時間3 h，pH值6.0，此時水解度高達 82.6%，與本實驗所得水解度32.90%相差較大，這可能與本實驗中采用的水解度測定方法—甲醛滴定法本身的靈敏度偏低有關(guān)，有關(guān)報道認(rèn)為它比茚三酮比色法的靈敏度要低兩個數(shù)量級［10］。此外，對于茚三酮法，它采用單一氨基酸作為標(biāo)準(zhǔn)進行測定，而不同的氨基酸對茚三酮的顯色度有偏差，并且比色測定時讀數(shù)不穩(wěn)定，很難讀出一個確切的數(shù)值，因此所得結(jié)果可能存在偏差，且該結(jié)果也與其他學(xué)者［8，11，12］在利用木瓜蛋白酶酶解螺旋藻蛋白研究中所得水解度大小有較大差異，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性有待考量。

本實驗采用雙酶法制備螺旋藻小分子肽，其水解度比利用單酶處理得到的水解度有明顯提高，可能說明利用雙酶法進行水解時，第二種酶可以利用前一種酶水解后的產(chǎn)物為底物再進行二次水解，或者是對前一種酶沒有水解的剩余螺旋藻蛋白進行了水解，這都會使蛋白水解度得到提高，使螺旋藻蛋白水解更徹底。同時，水解度的提高使螺旋藻蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為肽的概率更高，肽的產(chǎn)率也將得到提高。生物活性肽的研制作為國際上新興的生物高科技產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域，是具有極大市場潛力的朝陽產(chǎn)業(yè)，而螺旋藻是極易大規(guī)模化工業(yè)養(yǎng)殖的高蛋白質(zhì)單細(xì)胞體，通過雙酶法制備螺旋藻活性肽可提高營養(yǎng)成分的吸收利用率，提升產(chǎn)品附加值，并且為進一步從螺旋藻蛋白中分離純化出功能性多肽奠定了基礎(chǔ)。

1 Zhang ZY(張忠義).Biological evaluation of Spirulina.Food Sci Tech(食品科技)，1999，5:52-54.

2 Li K(李珂)，Yang XH(楊秀華)，Li ZJ(李宗軍)，et al.Optimization of enzymatic hydrolysis condition of pig bone collagen by response surface methodology.Food Sci(食品科學(xué))，2009，30，7:135-140.

3 William L，Steven DB.Enzymatic production hydrolysates for food use.Food Tech，1994，44:68-71.

4 Feng ZB(馮志彪)，Zhang W(張偉)，Li DM(李冬梅).The refining of hydrolysate of Spirulina Protein.Food Ind(食品工業(yè))，2002，3:3-4.

5 Peng WM(彭衛(wèi)民)，Shang ST(商樹田)，Liu GQ(劉國琴)，et alExtraction of phycobiliproteins from Spirulina platensis.Food Sci(食品科學(xué))，1999，20，6:48-49.

6 Yang LH(楊立紅)，Zou N(鄒寧)，Sun DH(孫東紅)，et al.Isolation phycocyanin from Anabaena sp.Food Fermn Ind (食品與發(fā)酵工業(yè))，2005，31，2:135-138.

7 Wu MM(武萌萌)，Liu SW(劉士偉).Preparation and purification of low-molecular-weight peptides from Spirulina protein.Acta Agric Zhejiangensis(浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報)，2010，22，6: 802-807.

8 Li XY(李欣悅).Study on the enzymatic hydrolysis technology for Arthospira(Spirulina)innermongoliansis.Beijing: Beijing Foresry University(北京林業(yè)大學(xué))，MSc.2008.

9 Wang C(王辰)，Liu F(劉芳).Study on the enzymatic hydrolysis of Spirulina protein.J Anhui Agric Sci(安徽農(nóng)業(yè)科學(xué))，2008，36，31:13485-13487.

10 Stauffer CE.Peptide hydrolases(in enzyme assays for food scientists).New York:Van Nostrand Rcinhold，1989.

11 Yang L(楊磊)，Xia N(夏寧)，Teng JW(滕建文)，et al.Enzymolysis technology optimization of active peptide production from Spirulina mud.Food Sci Tech(食品科技)，2009，34，12:244-249.

12 Wu SX(吳少雄)，Liu GD(劉光東)，Xiao JC(肖建春).Study on enzymatic hydrolysis of spirulina.Guangzhou Food Sci Tech(廣州食品工業(yè)科技)，1999，15，3:9-11.

Study on Preparation of Peptides from Spirulina Protein with Double Enzyme Method

SUN Yi-jun1，CHANG Rong1，ZHANG Jiao1，LIU Shi-wei1，LI Bo-sheng2*1School of Biology Science and Technology，Beijing Forestry University;2Spirulina institute，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China

Spirulina Protein was hydrolyzed by the combination of alkaline and papain proteinase.The hydrolysis conditions of papain were determined and optimized.The effects of enzyme dosage，temperature，pH and time on degree of hydrolysis were studied in single factor test.On this basis，response surface method(RSM)with three factors(enzyme dosage，temperature and pH)and three levels was designed.The result showed that the optimum conditions of alkaline were:enzyme dosage 4300 U/g，temperature 55℃，time 160 min and pH 7.0;the optimum conditions of papain were: enzyme dosage(E/S)4.5%，temperature 60℃，time 210 min，and pH 6.5.Spirulina protein can be effectively degradated into peptides by the combination of the two enzymes，and DH reached 32.90%，which was significantly higher than that obtained by single enzyme hydrolysis.

Spirulina peptides;alkaline;papain;hydrolysis conditions

1001-6880(2012)10-1468-07

2012-02-20 接受日期:2012-05-30

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(200704025);教育部重點研究項目(102023)

*通訊作者 Tel:86-013466711874;E-mail:Libs7321@126.com

Q949.22

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