狹苞橐吾中幾種倍半萜類化合物的活性篩選

柴 智，樊慧杰，王永輝，薛慧清

山西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)管理中心，太原030024

狹苞橐吾中幾種倍半萜類化合物的活性篩選

柴 智，樊慧杰，王永輝，薛慧清*

山西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)管理中心，太原030024

本文對(duì)山西狹苞橐吾中倍半萜類化合物的生物學(xué)活性進(jìn)行了篩選。用不同濃度的4種艾里莫芬烷型倍半萜干預(yù)攜帶有P53和SV40腫瘤病毒大T抗原基因的AH109菌液，采用酵母雙雜交系統(tǒng)的β-半乳糖苷酶活力測定方法，分析了4種倍半萜對(duì)P53蛋白與SV40大T抗原之間相互作用力的影響。發(fā)現(xiàn)8β-methoxyeremophil-7 (11)-ene-12，8α(4β，6α)-diolide(1)和8β-hydroxyl-6β-angloxyeremophil-7(11)-ene-12，8α-olide-15-oic acid(2)對(duì)P53蛋白及SV40-大T抗原相互作用沒有顯著影響，但是中、高濃度的furanoeremophilan-4β，6α-olide(3)和低、中、高濃度的8β-hydroxyeremophil-7(11)-ene-12，8α(4β，6α)-diolide(4)對(duì)P53蛋白與SV40大T抗原之間相互作用有抑制效應(yīng)。說明從山西狹苞橐吾中提取出的化合物3和4對(duì)酵母雙雜交系統(tǒng)中的P53和SV40-大T抗原的相互作用有生物學(xué)抑制活性。

狹苞橐吾;倍半萜;活性篩選

菊科橐吾屬植物約有130余種，分布于我國西北、西南、華北和東北［1］，其根、莖、葉皆可入藥，有清熱解毒、消炎殺菌、化痰止咳和活血止痛等功效，我國許多地區(qū)將多種該屬植物的根和根莖作為“紫菀”的替代品使用［2］，習(xí)稱為“山紫菀”或“川紫菀”等。故民間主要用于治療癰腫、風(fēng)濕感冒、咽喉炎、肺結(jié)核咯血、小便不利及跌打損傷等癥［3］。另有研究報(bào)道，本屬藍(lán)灰組植物網(wǎng)脈橐吾、側(cè)莖橐吾中的倍半萜成分具有抗腫瘤、抗菌等生物學(xué)活性［4］。山西有7種菊科橐吾屬植物［5］，其中包括狹苞橐吾。本研究小組對(duì)采自山西關(guān)帝山的狹苞橐吾進(jìn)行了較為系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，從中分離鑒定出28個(gè)化合物，其中13個(gè)為倍半萜類化合物［6-8］。本文對(duì)分離得到的4個(gè)含量較高的艾里莫芬烷型倍半萜的生物學(xué)活性進(jìn)行了研究，采用酵母雙雜交系統(tǒng)的β-半乳糖苷酶活力測定方法，以P53蛋白與SV40大T抗原之間的相互作用作為藥物分子靶標(biāo)，測定4個(gè)倍半萜類化合物對(duì)它們之間相互作用的影響，初步對(duì)4個(gè)倍半萜進(jìn)行活性篩選。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和試劑

MATCHMAKER雙雜交系統(tǒng)3(包括pGBKBT7質(zhì)粒包含Trp營養(yǎng)選擇和APR抗生素標(biāo)記，pGBADT7質(zhì)粒包含Leu營養(yǎng)選擇和Kanr抗生素標(biāo)記，pGBADT7-SV40，pGBKBT7-P53，pGBADT7-Lam質(zhì)粒，酵母菌AH109)(美國Clontech公司);攜帶人P53蛋白與SV40大T抗原相互作用的陽性克隆菌株AH109(本實(shí)驗(yàn)室自制)。YPD培養(yǎng)基(美國Clontech公司);鄰硝基苯-β-半乳吡喃糖苷(o-nitrophyl-β-D-galactopyranoside，ONPG;美國 Sigma公司);其余均為國產(chǎn)試劑。

1.1.2 陽性藥物順鉑(香港Faulding公司)，臨用前用無菌生理鹽水配制為l mg/mL的工作液。

1.1.3 倍半萜樣品

［9］，對(duì)4種倍半萜進(jìn)行了分離，并分別鑒定為:8β-methoxyeremophil-7(11)-ene-12，8α(4β，6α)-diolide(1)、8β-hydroxyl-6β-angloxyeremophil-7 (11)-ene-12，8α-olide-15-oic acid(2)、furanoeremophilan-4β，6α-olide(3)、8β-hydroxyeremophil-7 (11)-ene-12，8α(4β，6α)-diolide(4)。實(shí)驗(yàn)時(shí)稱取一定量的樣品，溶于二甲亞砜(DMSO)中，濃度為10 mg/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 儀器

ESCO Opti-MAIR ACB-A型超凈工作臺(tái)(新加坡藝思高科技有限公司);HZQ-F160全溫震蕩培養(yǎng)箱(上海安亭科學(xué)儀器制造廠);721型紫外分光廣度計(jì)(上海第三分析儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 樣品的毒性檢測

分別將50、100、150 μL待測樣品溶液加入5 mL含酵母菌AH109菌株的YPD培養(yǎng)基中，體積差用溶劑補(bǔ)齊;以加入150 μL YPD培養(yǎng)液，不加入待測樣品溶液為空白對(duì)照組。30℃、180 rpm振搖過夜。經(jīng)過16～18 h的培養(yǎng)，在波長600 nm處測定A值以判斷四種倍半萜類化合物對(duì)酵母生長的影響，實(shí)驗(yàn)平行三次。

1.2.2 系統(tǒng)檢測及樣品的活性篩選

在SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His液體培養(yǎng)基中活化攜帶有 P53和 SV40腫瘤病毒大 T抗原基因的AH109菌株(空白對(duì)照組)，在SD/-Leu/-Trp液體培養(yǎng)基中活化攜帶有層粘連蛋白Lam和SV40腫瘤病毒大T抗原基因的AH109菌株(陰性對(duì)照組);將藥品順鉑(陽性對(duì)照組)和4種倍半萜類化合物(實(shí)驗(yàn)組)分別按三個(gè)濃度接種于攜帶有P53和SV40腫瘤病毒大T抗原基因的AH109菌株的液體中，體積差用溶劑補(bǔ)齊，每個(gè)濃度接種三管(見表1)。30℃振搖(180 rpm)16～18 h后取出，以O(shè)NPG為反應(yīng)底物分析檢測β-半乳糖苷酶的活力。

表1 接種條件Table 1 Inoculation conditions

1.2.3 β-半乳糖苷酶測定及計(jì)算方法［10］

將菌液離心后，用Z-buffer清洗一次，再離心，棄上清，然后用0.3 mL Z-buffer重懸細(xì)胞。向1.5 mL微量離心管中加入0.1 mL菌液，在液氮中裂解2次以上，加入0.7 mL Z-buffer巰基乙醇、0.16 mL ONPG(4 mg/mL)，混勻后30℃保溫記時(shí)至溶液變黃，加入0.4 mL 1 M Na2CO3，混勻，14，000 rpm離心10 min，取上清液，比色法測定A420值。

β-半乳糖苷酶單位數(shù)［11］=1000×A420/(t×V ×A600)。其中:

t=反應(yīng)開始到溶液變黃的時(shí)間;V=0.1 mL×濃縮因子。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)檢測

β-半乳糖甘酶活力(IU)在陰性對(duì)照組為1.10 ±0.23，低濃度陽性對(duì)照組為22.35±0.57，而空白對(duì)照組為41.35±0.68，表明作者構(gòu)建的酵母雙雜交系統(tǒng)工作正常，可以定量檢測出目標(biāo)蛋白之間存在的相互作用。

2.2 樣品的毒性檢測結(jié)果

將不同濃度的4種倍半萜樣品加入含有AH109菌株的YPD培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16～18 h，測定各培養(yǎng)基的A600nm值。4種倍半萜的不同濃度組與空白對(duì)照組相比，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，即四個(gè)倍半萜類化合物均未顯示出對(duì)酵母生長有顯著性影響作用，同時(shí)排除了溶劑DMSO對(duì)酵母生長的影響。樣品可以用于后續(xù)活性篩選實(shí)驗(yàn)。

2.3 樣品的活性篩選結(jié)果

30℃保溫，180 rpm振搖過夜，在細(xì)胞生長16～18h后通過測定β-半乳糖苷酶活力反映酵母體內(nèi)P53蛋白與SV40大T抗原之間相互作用力的大小，進(jìn)而進(jìn)行樣品活性的篩選(見表2)。實(shí)驗(yàn)觀察到化合物1和化合物2與空白對(duì)照組相比，對(duì)P53合SV40-大T抗原的相互作用沒有顯著性差異?；衔?在50 μL時(shí)對(duì)P53和SV40-大T抗原之間的相互作用無明顯影響，在100 μL和150 μL時(shí)對(duì)兩蛋白的相互作用有明顯影響，但兩個(gè)體積之間比較無顯著性差異?；衔?在50、100、150 μL不同體積情況下，對(duì)兩蛋白的相互作用均有明顯抑制作用，抑制作用呈現(xiàn)增高趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表2 不同樣品對(duì)β-半乳糖苷酶活力的影響Table 2 Effects of differenrt samples on β-Galactose glucoside enzyme activity

3 討論

橐吾屬植物在我國分布廣泛，我國是在80年代中期開始對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行研究。為了增強(qiáng)療效、減小毒性，本課題組前期分離純化了其中的化學(xué)成分倍半萜，本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步對(duì)這類化合物進(jìn)行活性篩選研究。

酵母雙雜交系統(tǒng)是一種在酵母體內(nèi)研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間相互作用的快速靈敏的方法［12］，其在小分子化合物藥物篩選方面，具有巨大潛力。P53蛋白是一種抑癌基因產(chǎn)物，當(dāng)P53蛋白與病毒癌蛋白SV40大T抗原之間相互作用時(shí)會(huì)導(dǎo)致其功能的喪失從而引起多種癌變的發(fā)生［13］，本課題選擇攜帶人P53蛋白與SV40大T抗原為酵母雙雜交系統(tǒng)的靶蛋白對(duì)，通過分析β-半乳糖苷酶活力來明確4種倍半萜對(duì)酵母體內(nèi)P53蛋白與SV40大T抗原之間相互作用力的大小。

本課題應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)的β-半乳糖苷酶活力測定方法，研究來自于山西關(guān)帝山狹苞橐吾的4個(gè)倍半萜類化合物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)中、高劑量的化合物3和低、中、高劑量的化合物4對(duì)于P53蛋白與SV40大T抗原之間的相互作用力有影響，分別在一定程度上降低這兩個(gè)蛋白之間的相互作用力;其中，化合物4隨著樣品量得增加，對(duì)兩蛋白相互作用的抑制作用呈輕微增高趨勢。雖然不同劑量的化合物1和化合物2對(duì)P53和SV40-大T抗原之間的相互作用均沒有顯著影響，但不排除它們可以與加強(qiáng)或抑制作用的組分起協(xié)同作用。這些仍需要進(jìn)一步的深入研究。本課題結(jié)果從分子水平闡明倍半萜的生物學(xué)活性，并為采自山西關(guān)帝山狹苞橐吾中提取的倍半萜類化合物的潛在抗腫瘤藥物機(jī)理提供了一些啟示。

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9Xue HQ(薛慧清)，Ma XM(馬雪梅)，Wei XN(魏小寧)，et al.Study on chemical constiuents from Ligularia intermedia of Shanxi.Chin J Chin Mate Med(中國中藥雜志)，2007，32:1044-1047.

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Activity Screening on Sesquiterpene Compounds from Ligularia intermedia Nakai of Shanxi

CHAI Zhi，F(xiàn)AN Hui-jie，WANG Yong-hui，XUE Hui-qing*
Shanxi College of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan 030024，China

To study the biological activity of sesquiterpene compounds from Ligularia intermedia Nakai of Shanxi.With different concentrations of four kinds of sesquiterpenes intervening AH109 bacteria solution which carries P53 and SV40 tumor virus large T-Antigen genes，we adopted yeast two-hybrid system method for determination of beta-galactose glucoside enzyme activity to analyze the interaction effects on P53 protein and SV40 large T-antigen by the four compounds.The results indicated that 8β-methoxyeremophil-7(11)-ene-12，8α(4β，6α)-diolide(1)and 8β-hydroxyl-6β-angloxyeremophil-7(11)-ene-12，8α-olide-15-oic acid(2)had no significant effects on the interaction between P53 protein and SV40-large T-antigen.However，medium and high concentrations of furanoeremophilan-4β，6α-olide(3)，low，medium and high concentration of 8β-hydroxyeremophil-7(11)-ene-12，8α(4β，6α)-diolide(4)had an inhibitory effects on the interaction between P53 protein and SV40 large T-antigen.It showed that compounds 3 and 4 which extracted from Ligularia intermedia Nakai of Shanxi had biological inhibitory activity effects on the interaction between P53 and SV40-large T-Antigen of the yeast two-hybrid system.

Ligularia intermedia;sesquiterpenes;activity screening

1001-6880(2012)10-1408-04

2011-12-31 接受日期:2012-03-22

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20080311052-1);山西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2009011013-1)

*通訊作者 Tel:86-351-2272277;E-mail:xuehuiqing@sina.com

R284.2

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