鵝新城疫病例診斷報(bào)告

蔣運(yùn)博，谷松至，杜東菊，王 新，董 浩，胡桂學(xué)

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130118）

1 發(fā)病情況

吉林省梅河口市某鵝場(chǎng)共飼養(yǎng)6 800只鵝，其中包括6 000只榔頭鵝的種鵝和800只吉林白鵝。本實(shí)驗(yàn)室從該場(chǎng)購(gòu)買了20只吉林白鵝。購(gòu)買前此批鵝無(wú)任何發(fā)病跡象，經(jīng)近5h的汽車運(yùn)輸?shù)竭_(dá)本校。自購(gòu)買后次日開(kāi)始，少數(shù)鵝出現(xiàn)食欲不振、精神委靡等癥狀，第5天后開(kāi)始出現(xiàn)死亡。在購(gòu)置這批鵝之前，該鵝場(chǎng)未曾有過(guò)關(guān)于疫情的報(bào)告，但在該鵝場(chǎng)周邊，有散養(yǎng)的雞和不明原因死去的雛鵝，死亡雛鵝未進(jìn)行無(wú)害化處理和掩埋。該養(yǎng)殖場(chǎng)管理不夠嚴(yán)格，人員可自由出入。經(jīng)同期調(diào)查，鵝場(chǎng)同批飼養(yǎng)的榔頭鵝與吉林白鵝也有少數(shù)發(fā)病。

2 臨床癥狀與病理剖檢

病鵝表現(xiàn)為逐漸消瘦，腳軟無(wú)力，行走搖擺不穩(wěn)；頭縮頸軟，采食減少或廢絕；張口呼吸，甩頭；排黃綠色稀便，產(chǎn)軟殼蛋和畸形蛋。

隨機(jī)剖檢3只病死鵝發(fā)現(xiàn)，腺胃有明顯的滲出性出血；肝臟、腎臟、脾臟有不同程度的腫大、充血；氣管、腸道出血；胰臟腫大、質(zhì)地硬而脆；卵黃流入腹腔、質(zhì)地堅(jiān)硬且形狀不規(guī)則。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1 細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn) 取鵝的肝臟和脾臟，涂片、染色、鏡檢，未見(jiàn)細(xì)菌。無(wú)菌操作取心血和肝臟，經(jīng)普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)，結(jié)果均未分離到細(xì)菌。

3.2 病毒分離 取死亡鵝的肝臟和脾臟，用研缽研碎，以無(wú)菌PBS制成組織懸液，離心后取上清加入雙抗過(guò)夜。次日接種15只9日齡雞胚，24h內(nèi)雞胚死亡2只，認(rèn)為是操作失誤棄去；其余13只雞胚分別在48～72h內(nèi)死亡，提取并保存雞胚尿囊液。觀察死亡雞胚，發(fā)現(xiàn)胚體全身充血，頭部和肢端尤為明顯，且有點(diǎn)狀出血。

3.3 病毒的鑒定

3.3.1 血凝試驗(yàn)與血凝抑制試驗(yàn) 將雞胚尿囊液倍比稀釋，與1%雞紅細(xì)胞懸液做血凝試驗(yàn)，結(jié)果死亡雞胚混合尿囊液能凝集雞紅細(xì)胞，血凝效價(jià)為1∶32。取4個(gè)血凝單位雞胚尿囊液與雞新城疫、禽流感H5和H9陽(yáng)性血清進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)，結(jié)果為新城疫病毒陽(yáng)性血清血凝抑制試驗(yàn)呈陽(yáng)性。

3.3.2 RT－PCR鑒定 取病毒尿囊液按常規(guī)方法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR鑒定。根據(jù)文獻(xiàn)［1］報(bào)道，合成新城疫強(qiáng)、弱毒鑒定引物。引物A＋B為針對(duì)NDV的通用引物，引物A＋C為針對(duì)NDV的強(qiáng)毒的引物，A＋D為針對(duì)NDV的弱毒的引物，引物序列及其位置如表1。

表1 引物的序列及其位置

PCR反應(yīng)在25μL反應(yīng)體系中進(jìn)行：d NTP 2.0μL、ddH2O 17.2μL、模板cDNA 2.0μL、上下游引物各1.0μL、TaqDNA聚合酶0.3μL、10×PCR緩沖液2.5μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)處理4min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)反應(yīng)包括：94℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，循環(huán)完成后，72℃充分延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，在120V條件下電泳30min結(jié)果如圖1。

由圖1可見(jiàn)，3泳道出現(xiàn)目的條帶證明該病毒為新城疫病毒，2泳道出現(xiàn)目的條帶同時(shí)1泳道未見(jiàn)條帶，證明該病毒為新城疫強(qiáng)病毒。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

4 討論

通過(guò)對(duì)此批吉林白鵝的發(fā)病情況、臨床癥狀、病理剖檢的觀察，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，確定造成此批白鵝死亡的病原為鵝新城疫病毒。

新城疫病毒基因組為單分子負(fù)鏈單股RNA，大小為15～16kb，包括六段基因，編碼6個(gè)主要的蛋白質(zhì)，其中F蛋白是最主要的糖蛋白之一［2］，具有良好的免疫原性，是病毒毒力的主要決定因素。由于NDV毒力強(qiáng)弱與F蛋白裂解位點(diǎn)區(qū)112～117位氨基酸序列的組成有關(guān)，弱毒株在該區(qū)的氨基酸序列為GR（K）QGRL，強(qiáng)毒株為 RRQK（R）RF［3］。本試驗(yàn)據(jù)此設(shè)計(jì)了 RT－PCR 引物［4－6］，此引物可以用于新城疫強(qiáng)、弱毒株的鑒定。根據(jù)RT－PCR結(jié)果推出，該場(chǎng)鵝攜帶的為新城疫強(qiáng)毒。通常認(rèn)為鵝新城疫病毒不感染水禽，而水禽常作為其攜帶者，但不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀。任濤等曾用新城疫病毒攻擊28日齡的鵝，未引起接種鵝發(fā)病和死亡［7］。因此推測(cè)引起此批白鵝發(fā)病的原因有以下幾點(diǎn)。首先，我國(guó)商品雞群中普遍存在ND強(qiáng)病毒。NDV污染雞場(chǎng)后，在病雞體內(nèi)大量復(fù)制、循環(huán)，使毒力增強(qiáng)，并長(zhǎng)期維持下去，一旦遇到免疫水平低的雞群或免疫力不足的雞，極易發(fā)生非典型ND，本批外購(gòu)鵝受長(zhǎng)途運(yùn)輸、環(huán)境變化等各種應(yīng)激因素影響導(dǎo)致鵝抵抗力下降，從而引發(fā)鵝體內(nèi)新城疫病毒大量增殖；其次，雖然該鵝場(chǎng)內(nèi)的成年鵝未見(jiàn)發(fā)病，但在鵝場(chǎng)周圍有不明原因死亡而隨便丟棄的未經(jīng)無(wú)害化處理的雛鵝，同時(shí)周邊有散養(yǎng)雞的存在，因此此批鵝感染新城疫病毒可能與雞鵝混養(yǎng)有關(guān)；再次，該養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)管理不善，衛(wèi)生條件差，各種人員可以自由出入，沒(méi)有完善的消毒措施，也可能是造成此批鵝感染新城疫病毒的原因。建議采取的防制措施為：加強(qiáng)運(yùn)輸過(guò)程中的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件，減小應(yīng)激反應(yīng)造成的發(fā)??；加強(qiáng)養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)的衛(wèi)生管理措施，不但進(jìn)鵝前進(jìn)行徹底消毒，而且進(jìn)鵝后也要定期消毒，平時(shí)應(yīng)禁止所有可能帶毒的動(dòng)物進(jìn)入圈舍，并嚴(yán)格妥善處理病死畜禽；加強(qiáng)對(duì)人員的管理，出入時(shí)應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格消毒。

［1］Kant A，Koch G，van D J，etal.Differentiation of virulent and non－virulent strain of Newcastle disease viruswithin 24hours by polymerase chian reaction［J］.Avian Pathol，1997，26：837－849.

［2］劉成宏，金擴(kuò)世，金寧一，等.新城疫強(qiáng)毒株F蛋白裂解位點(diǎn)串聯(lián)基因的構(gòu)建及原核表達(dá)［J］.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2007，20（2）：73－76.

［3］Paterson R G，Shang hnessy M A，Lamb R A.Analysis of the relationship between cleavability of a paramyxovirus fusion protein and length of connecting peptide［J］.J Virol，1989，63：1293－1301.

［4］宋長(zhǎng)緒，劉福安.新城疫病毒的分子生物學(xué)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，1998，19（1）：9－12.

［5］金擴(kuò)世，金寧一，王興龍.新城疫病毒弱毒株分子生物學(xué)特性的研究［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，22（3）：193－195.

［6］張秀根，樊生超，繆德年.一株新城疫病毒新強(qiáng)毒株（NL）的分離鑒定及 F 基因序列測(cè)定［J］.病毒學(xué)報(bào)，2000，16（4）：352－356.

［7］呂曉娟，龔建森，劉學(xué)賢，等.鵝副黏病毒分離株的生物學(xué)特性鑒定［J］.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，35（4）：530－534.