沙棘皮渣中哈爾滿堿制備技術(shù)研究

山永凱

（青海青美生物資源研究開發(fā)有限公司，青海西寧 810016）

沙棘，又稱醋柳、酸刺，是一種多年生的灌木或小喬木，屬于胡頹子科（Elaeagnaceae）沙棘屬（HippophaeL.）［1，2］富含生物活性物質(zhì)的天然植物［3］。沙棘果中除含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物外，還有人體必需的多種維生素和無機(jī)鹽，其中維生素含量豐富，尤以VC含量為高，幾乎居一切果蔬之冠。

沙棘果具有很高的食用和藥用價(jià)值。沙棘果含有沙棘黃酮、超氧化物歧化酶（SOD）、ω－6多不飽和脂肪酸、哈爾滿堿、5－羥色胺等對人體具有特殊保健作用的生物活性物質(zhì)。具有活血化瘀、化痰寬胸、補(bǔ)脾健胃、生津止渴、清熱止瀉、消炎生肌、抑制腫瘤等功效。沙棘產(chǎn)品在食品和藥品行業(yè)被廣泛應(yīng)用，倍受企業(yè)和相關(guān)行業(yè)的青睞［4］。

哈爾滿堿（Harmane），異名去甲氧去氫駱駝蓬堿；2－甲基－B－咔啉；3－甲基－4－咔啉，廣泛存在于最大革蓋菌（Coriolusmaximus）、蘑菇和植物體，屬于B－咔啉生物堿。分子式為C12H10N2，分子量為182.22，結(jié)構(gòu)式見圖1。為黃褐色粉末或結(jié)晶體，熔點(diǎn)230～232℃，在紫外燈下呈亮藍(lán)色熒光。主要用于真菌所致的癬類皮膚病、濕疹、燒傷、靜脈曲張性潰瘍等癥（趾間發(fā)癬菌，MIC＝1.6～200.0μg／mL）；低劑量時(shí)為運(yùn)動(dòng)抑制劑，高劑量時(shí)引起驚厥；抑制活性鈉轉(zhuǎn)移，Na＋，K＋－腺苷三磷酸酶抑制劑；植物生長調(diào)節(jié)劑；子宮興奮劑。臨床上將哈爾滿用于治療腎上腺素或去甲腎上腺素水平低下所引起的疾病?？苫钛觥⒅慰人?、勞傷吐血、跌打、月經(jīng)不調(diào)。

圖1 哈爾滿堿結(jié)構(gòu)式

沙棘的根、莖、葉、花、果都含有豐富的生理活性物質(zhì)和哈爾滿堿。目前哈爾滿堿大多從茜草科植物蛇根草（OphiorrhizajaponieaBl.）的全草中提取，而以沙棘果皮渣為原料提取哈爾滿堿在國內(nèi)還未見報(bào)道。所以，以生產(chǎn)下腳料——沙棘皮渣為原料，提取哈爾滿堿，不僅可以提高沙棘產(chǎn)品的附加值，而且實(shí)現(xiàn)了原料的優(yōu)化配置。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料

沙棘果（青海清華博眾生物技術(shù)有限公司）；沙棘皮渣；乙醇；大孔樹脂。

1.1.2 儀器設(shè)備

超聲波提取機(jī)；液相色譜儀；干燥箱；離心機(jī)；粉碎機(jī)等。

1.2 提取流程及操作要點(diǎn)

1.2.1 提取工藝流程

本實(shí)驗(yàn)的工藝過程分為二部分。

第一部分是沙棘的前處理。沙棘果是資源利用的源頭，通過對不同部位原料的處理，可以得到沙棘果汁、沙棘種籽等用于高附加值產(chǎn)品開發(fā)的產(chǎn)品，沙棘皮渣經(jīng)過干燥粉碎后，用來進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，提取目標(biāo)產(chǎn)物。工藝流程如下：

第二部分是目標(biāo)產(chǎn)物的提取，工藝流程如下：

1.2.2 操作要點(diǎn)

（1）沙棘果枝條的采收和清洗

采集的帶果沙棘枝條長度小于5cm，粗小于6mm，可帶少許葉；剔出生青果、病爛果和泥漿果，以及石塊、金屬器具等硬物、異物。采集的沙棘果須用木制或竹制容器盛裝，不得用其他材料制成的容器盛裝。清洗用水必須符合GB5749的規(guī)定，加工環(huán)境要清潔衛(wèi)生，盡量消除有害生物的發(fā)生繁殖，防止有害生物接觸加工和處理設(shè)備。

（2）離心取汁

沙棘果經(jīng)沖洗干凈后用PK－121R 離心機(jī)高速（4000 轉(zhuǎn)／min）離心分離，得清汁，清汁收集后用于生產(chǎn)沙棘汁為原料的其他產(chǎn)品，如沙棘飲料、沙棘酒、沙棘果醋、沙棘口服液、沙棘果粉、沙棘維生素P 粉等產(chǎn)品。沙棘果離心機(jī)轉(zhuǎn)速要求3500～4500 轉(zhuǎn)／min、離心6min 時(shí)，出汁率達(dá)78%以上。

（3）種籽與果皮的分離

沙棘果經(jīng)離心機(jī)高速（4000 轉(zhuǎn)／min）離心分離后得到果皮與種籽，經(jīng)過晾曬、脫皮、篩選等工序，分離出其中的沙棘種籽、枝條，收集果皮渣。沙棘果皮渣經(jīng)過干燥、粉碎、過篩后備用，做為提取哈爾滿堿的原料。

（4）目標(biāo)產(chǎn)物的提取

采用超聲波提取法，以乙醇為溶劑，通過實(shí)驗(yàn)，確定適宜的乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比、提取時(shí)間及提取次數(shù)，得出哈爾滿堿最佳提取參數(shù)。

（5）樹脂純化

將大孔樹脂D101用95%乙醇浸泡24h，使其充分膨脹，濕法裝柱，然后用95%乙醇液洗至流出液無白色混濁現(xiàn)象，再用去離子水洗凈乙醇，直至流出液無渾濁為止。取最佳優(yōu)化工藝的提取液，確定提取液與樹脂用量（柱體積）比約為1∶1（g／mL）上樣，選用洗脫劑為80%乙醇，洗脫體積為5個(gè)柱體積，收集洗脫液，薄層層析判斷有效成分。有效洗脫成分減壓濃縮濾液，真空干燥。

（6）檢測

對所得的目標(biāo)提取物，用高效液相色譜法進(jìn)行測定。

1.3 實(shí)驗(yàn)測定

1.3.1 檢測波長的確定

取哈爾滿堿對照品適量，加甲醇稀釋后作為對照品溶液，以甲醇為參比，用紫外分光光度計(jì)在200～400nm 波長范圍內(nèi)掃描，測定哈爾滿堿在280nm 和335nm 處有較大的吸收，經(jīng)試驗(yàn)比較最后確定選擇280nm 為檢測波長。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Shim－pack ODS C18柱（6.0mm×150mm，5μm），流 動(dòng) 相：V（甲 醇）：V（0.025mol／L磷酸三乙胺）＝20：80，檢測波長280nm，流速1ml／min，柱溫40℃，理論塔板數(shù)按哈爾滿堿峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。

圖2 哈爾滿堿對照品的HPLC圖譜

1.3.3 流動(dòng)相的選擇

采用不同體系的流動(dòng)相進(jìn)行比較試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以V（甲醇）∶V（0.025mol／L 磷酸三乙胺）＝20∶80為流動(dòng)相條件下，供試液中哈爾滿堿與相臨組分分離度良好，且保留時(shí)間適宜，方法 重復(fù) 性好。故選 擇 V（甲 醇）∶V（0.025mol／L 磷 酸三 乙 胺）＝20∶80 作 為 流動(dòng)相。

1.3.4 對照溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的哈爾滿堿對照品0.00339g，置100mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。即得0.0339mg／mL的對照品溶液。

1.3.5 樣品溶液的制備

精密稱取提取物0.5g，置于具塞錐形瓶中，精密加50%甲醇50mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減少的質(zhì)量，搖勻，過濾，精密量取過濾液5mL，置25mL 棕色容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得。色譜圖見圖3。

1.3.6 線性關(guān)系

精密吸取濃度為0.0339mg／mL 的哈爾滿對照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μL，按上述色譜條件測定峰面積，以哈爾滿對照品峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程如下：Y＝35678.9321x＋59578.1069，相關(guān)系數(shù)r＝0.9991。

圖3 哈爾滿堿樣品的HPLC圖譜

結(jié)果表明，哈爾滿堿的進(jìn)樣量在0.0678～0.3391μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

1.3.7 精密度實(shí)驗(yàn)

在上述色譜條件下，精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10μL，分別注入高效液相色譜儀，各進(jìn)樣5次，測定供試品溶液中哈爾滿堿峰面積和對照品的RSD 分別為1.95%和0.39%（n＝5），結(jié)果表明精密度良好。

1.3.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

在上述色譜條件下，精密吸取同一供試品溶液各10μL，分別注入液相色譜儀測定，然后隔12h各考察1次。結(jié)果表明，供試品溶液至少在48h內(nèi)測定結(jié)果穩(wěn)定，供試品溶液哈爾滿堿峰面積的RSD 為2.4%（n＝5）。

1.3.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

稱取提取物0.5g，共5 份，按樣品溶液制備方法制備供試品溶液；對照品溶液濃度為0.0339mg／mL。按含量測度方法進(jìn)行測定，測得哈爾滿堿的平均含量為0.02260%，RSD 為1.10%（n＝5），說明本方法重復(fù)性良好。

1.3.10 回收率試驗(yàn)

取已知哈爾滿堿含量的沙棘皮渣5g，稱定，共稱取5份，分別置具塞錐形瓶中，各分別加入一定量的哈爾滿堿對照品，按供試品制備方法制成供試品溶液，并按含量測定方法進(jìn)行測定，按以下公式計(jì)算回收率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，哈爾滿堿平均回收率為96.11%（n＝5），RSD＝1.71%。說明該測定方法測定結(jié)果準(zhǔn)確。

1.3.11 樣品含量的測定

取制備好的提取溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣，測定峰面積，平行3次，按外標(biāo)法計(jì)算平均含量。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 原料的得率

為了比較準(zhǔn)確地計(jì)算目標(biāo)產(chǎn)物的實(shí)際含量與提取率，首先對所使用的實(shí)驗(yàn)原料沙棘皮渣在沙棘中的得率進(jìn)行了測定，結(jié)果見表1。

表1 離心取汁后沙棘皮渣的得率

實(shí)驗(yàn)的沙棘果，經(jīng)過取汁、取籽后得到約3.75%的沙棘皮渣。

2.2 哈爾滿提取實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)采用超聲波提取法對哈爾滿堿進(jìn)行提取，在提取過程中，分別對各種影響因素進(jìn)行篩選，對影響較大的因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定出各種方法的最佳因素水平組合。

2.2.1 提取單因素實(shí)驗(yàn)

超聲波提取法提取目標(biāo)產(chǎn)物時(shí)，確定5個(gè)單因素為乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)、pH 值。試驗(yàn)因素水平表見表2。

表2 試驗(yàn)因素水平

2.2.2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)

根據(jù)Box－Benhnken 中心組和試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選取因素水平。試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表3。

表3 試驗(yàn)因素水平

2.3 提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對哈爾滿堿得率的影響

2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對哈爾滿堿得率的影響

由圖4可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，哈爾滿堿的得率也增大。這與所提取物質(zhì)的結(jié)構(gòu)有關(guān)。乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，提取物的溶解性增大。因此，得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增加；但是當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時(shí)，其它組分也大量溶出，另一方面也增加了成本，并為乙醇回收帶來困難，綜合考慮乙醇體積分?jǐn)?shù)以90%左右較好。

圖5 液料比對哈爾滿堿得率的影響

2.3.2 液料比對哈爾滿得率的影響

從圖5可知，料液比對哈爾滿堿得率有影響。當(dāng)液料比小于35時(shí)，哈爾滿堿得率增加較快，當(dāng)液料比大于35時(shí)，得率有所下降。這可能是由于溶劑添加量增大，有效成分在由固體組織向外擴(kuò)散的過程中，濃度梯度增大，擴(kuò)散速率提高，有利于提高得率。因此選擇液料比為35適宜。

圖6 提取時(shí)間對哈爾滿堿得率的影響

2.3.3 提取時(shí)間對哈爾滿堿得率的影響

由圖6可知，不同提取時(shí)間對哈爾滿堿得率影響不大。這是由于超聲波提取，能夠使細(xì)胞在很短的時(shí)間內(nèi)破碎，溶劑能迅速滲透到細(xì)胞內(nèi)部，而且目標(biāo)提取物能夠快速達(dá)到溶解平衡，因此提取時(shí)間較短。延長提取時(shí)間并不能明顯增加哈爾滿堿得率。因此，選擇提取時(shí)間為70min為宜。

圖7 提取次數(shù)對哈爾滿堿得率的影響

2.3.4 提取次數(shù)對哈爾滿堿得率的影響

由圖7可知，提取次數(shù)為1－3次時(shí)，哈爾滿堿得率增加迅速，當(dāng)提取次數(shù)大于4次時(shí)，哈爾滿堿得率反而降低，其原因可能是提取液體積較大時(shí)，濃縮時(shí)受熱時(shí)間長，使哈爾滿堿破壞。為了節(jié)約溶劑、節(jié)省濃縮時(shí)間，采用2 次提取適宜。

2.3.5 提取溫度對哈爾滿堿得率的影響

如圖8可知，可以看出適當(dāng)?shù)奶岣咛崛囟葧?huì)使得率增加，在溫度為70℃時(shí)提取率達(dá)到最大值，隨著溫度的繼續(xù)提高，提取率趨于下降?？赡苁菧囟冗^高會(huì)使得哈爾滿堿發(fā)生化學(xué)反應(yīng)含量降低。故選擇70℃左右。

圖8 提取溫度對哈爾滿堿得率的影響

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1 試驗(yàn)結(jié)果

選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度，以哈爾滿堿得率為響應(yīng)值Y，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表4。其中1～12是析因試驗(yàn)，13～15是中心試驗(yàn)，用來估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。

表4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.4.2 回歸方程

乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、提取時(shí)間（X2）、提取溫度（X3）對哈爾滿堿得率的曲面擬合方程為：

由回歸方程得出，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，按照對結(jié)果的影響排序：X2＞X3＞X1，即：提取時(shí)間＞提取溫度＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。經(jīng)SAS軟件運(yùn)行得出，最佳工藝參數(shù)是：乙醇體積分?jǐn)?shù)為74%，提 取 時(shí) 間 為72min，提 取 溫 度為72.6℃。

圖9 三因素響應(yīng)面圖

2.5 大孔樹脂純化

采 用 AB－8、ADS－3、ADS－5、NKA－9、D101、D4006五種大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附對比試驗(yàn)，從中選擇分離效果好，吸附容量大，容易洗脫和再生的樹脂作為純化目標(biāo)產(chǎn)物的層析柱填充料。采用梯度洗脫的方法，使雜質(zhì)與目標(biāo)產(chǎn)物分離。依次選用蒸餾水、30%、50%、70%、90%（V／V）乙醇（pH＝8）溶液作為層析柱洗脫劑，結(jié)果顯示，選用D101吸附樹脂，在流速為1mL／min，收集乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%時(shí)的洗脫液，所得目標(biāo)產(chǎn)物純度最高。

2.6 提取率計(jì)算

通過所設(shè)計(jì)工藝進(jìn)行沙棘皮渣中哈爾滿堿的提取和分離，1000g沙棘皮渣中可提取到32%的7.67g哈爾滿堿提取物。

3 結(jié)論

本研究對沙棘皮渣中提取哈爾滿堿的工藝進(jìn)行了全面的分析和研究。采用超聲波提取法，以乙醇為溶劑，通過實(shí)驗(yàn)，得出哈爾滿堿最佳提取參數(shù)。確定適宜的乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%、提取溫度為70℃、料液（V∶m）比35，提取時(shí)間70min，提取次數(shù)為2次，提取液經(jīng)大孔樹脂純化，最后用高效液相色譜法檢測目標(biāo)產(chǎn)物含量。通過所設(shè)計(jì)工藝進(jìn)行沙棘皮渣中哈爾滿堿的提取和分離，1000g沙棘皮渣中可提取到32%的哈爾滿提取物7.67g。

沙棘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展將促進(jìn)我國三北地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，幫助農(nóng)民增加收入，可實(shí)現(xiàn)社會(huì)經(jīng)濟(jì)與生態(tài)環(huán)境的協(xié)調(diào)和可持續(xù)發(fā)展，符合發(fā)展和諧社會(huì)的宗旨。發(fā)展沙棘產(chǎn)業(yè)使沙棘資源保護(hù)和開發(fā)并舉，有利于農(nóng)村調(diào)整產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)和經(jīng)濟(jì)協(xié)調(diào)發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)將沙棘產(chǎn)品的下腳料沙棘皮渣進(jìn)行利用，增加了沙棘產(chǎn)品的開發(fā)深度，但應(yīng)該繼續(xù)提高本研究所屬哈爾滿堿的純度和提取率，并研究更好的分離技術(shù)，開發(fā)高純度生物藥用原料。在提取沙棘哈爾滿堿的同時(shí)，在廢棄的原料中進(jìn)一步分離提取沙棘黃色素、原花青素等高價(jià)值生物物質(zhì)，可提高提取過程中生物成分的最大利用度和綜合利用程度。

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［2］黃銓，于倬德.沙棘研究 ［M］.北京：科學(xué)出版社，2006.6.

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