瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)卵黃抗體效價(jià)影響因素的分析

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瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)卵黃抗體效價(jià)影響因素的分析

王尚明①吳好停②宗玉東③（①山東迅達(dá)康獸藥有限公司 濟(jì)南 250316 ②中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 北京 ③山東省廣饒縣畜牧局）

抗體瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)是當(dāng)前卵黃抗體效價(jià)測(cè)定的主要方法之一，該方法簡(jiǎn)潔、快速非常適合于臨床中應(yīng)用，但是該方法容易受到多種因素的影響而導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果判斷的不準(zhǔn)確。本文就瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)中抗原抗體本身性質(zhì)、反應(yīng)特點(diǎn)、最適比例、可逆性、總量以及瓊脂、水等所有能影響試驗(yàn)結(jié)果的因素進(jìn)行了逐一分析。

卵黃瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)是通過抗原、卵黃抗體在瓊脂凝膠中由近及遠(yuǎn)不斷自由擴(kuò)散形成濃度梯度，在適當(dāng)比例處相遇形成沉淀線，并由此來判斷抗體效價(jià)的一種技術(shù)。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)主要是用于可溶性膠原性抗原及其所對(duì)應(yīng)抗體水平的檢測(cè)，獸醫(yī)臨床中主要用于法氏囊病、新城疫等抗體效價(jià)的檢測(cè)。由于卵黃內(nèi)抗體效價(jià)與雞體血清內(nèi)的效價(jià)幾乎相同，所以通過瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定卵黃抗體的效價(jià)，可以在不刺激雞體的情況下就可知道產(chǎn)蛋雞的抗體水平和免疫效果。卵黃瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、所用的儀器少、結(jié)果易判斷，因此被越來越多的養(yǎng)殖戶、獸醫(yī)工作者所采用，成為制定產(chǎn)蛋雞免疫程序的主要依據(jù)。但是瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的結(jié)果容易受到抗原抗體因素、瓊脂、反應(yīng)條件以及其它因素的影響而導(dǎo)致抗體效價(jià)測(cè)定不準(zhǔn)確。為了能使臨床中廣大實(shí)驗(yàn)操作人員在瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)中獲得一個(gè)更加準(zhǔn)確的結(jié)果及正確認(rèn)識(shí)，現(xiàn)將以上各種影響因素分析如下。

1 抗原抗體因素

瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)受抗原抗體本身性質(zhì)、抗原抗體反應(yīng)特點(diǎn)及其它因素的直接影響。

1.1 抗原抗體的性質(zhì)

1.1.1 抗體性質(zhì) 抗體的特異性與親和力是影響瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的主要因素?？贵w的特異性是由抗體可變區(qū)的原子空間排列及其電子結(jié)構(gòu)和極化特性決定的(王明俊等，1997)，親和力是復(fù)雜抗原與相應(yīng)抗體之間的總的結(jié)合能力(余傳霖等，1998)?？贵w的親和力很低時(shí)不易用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定。一般情況下，在免疫初期，卵黃抗體的特異性較高但親和力不高，后期，卵黃抗體的親和力高但相應(yīng)的特異性變低。

1.1.2 抗原性質(zhì) 抗原的種類、抗原決定簇的數(shù)目和理化性質(zhì)等因素都能影響瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的結(jié)果。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)是利用可溶性的抗原與抗體在瓊脂凝膠網(wǎng)格中的水中自有擴(kuò)散，相互結(jié)合形成的沉淀線來判斷結(jié)果的。這樣就要求抗原與抗體必須都是可溶性的，因?yàn)橐恍╊w粒性的抗原如細(xì)菌、紅細(xì)胞等是不溶的，這樣的抗原相對(duì)應(yīng)的卵黃抗體效價(jià)就不能用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)來測(cè)定。在瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)中要求抗原是多價(jià)的(抗原決定簇≥2)，單價(jià)抗原不能形成抗原抗體復(fù)合物，因此不能產(chǎn)生可見反應(yīng)?？乖姆肿恿?、pH值等理化因素也直接影響到試驗(yàn)的結(jié)果。

1.2 抗原抗體的反應(yīng)特征

抗原抗體反應(yīng)特征影響瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果的因素有：抗原抗體最適比、抗原抗體反應(yīng)的可逆性、抗原抗體的量。

1.2.1 抗原抗體的最適比 抗原抗體的反應(yīng)雖決定于兩者的化學(xué)構(gòu)型的相應(yīng)性，但不同于一般的化學(xué)反應(yīng)，其結(jié)合比例不完全符合化學(xué)反應(yīng)的質(zhì)量作用定律，因?yàn)榭乖贵w的結(jié)合是一種多價(jià)相互作用的結(jié)合。抗原根據(jù)分子大小的不同，結(jié)合位點(diǎn)變化很大，由10~50不等，有的甚至達(dá)到200個(gè)；卵黃中的抗體成份主要是IgG，有2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，卵黃抗體除了常見的雞傳染性法氏囊病抗體外，還有鴨病毒性肝炎、豬瘟(邊傳周等，1999)等高免卵黃抗體，這些抗體的效價(jià)都可以用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)來測(cè)定。當(dāng)抗原抗體的濃度比例適宜時(shí)，抗原抗體結(jié)合后尚未達(dá)到飽和的位點(diǎn)可與其它游離的抗原抗體繼續(xù)結(jié)合，逐漸形成越來越大的復(fù)合物。最后在抗原與抗體孔之間形成肉眼可見的沉淀線。此時(shí)反應(yīng)最快、最明顯。但當(dāng)兩者的量不適合時(shí)，少的一方在聚合初期就達(dá)到飽和，沉淀線變得不清晰甚至沒有沉淀線，而且沉淀線偏移，向量少的一方移動(dòng)。

1.2.2 抗原抗體反應(yīng)的可逆性 抗原抗體之間的結(jié)合是依靠分子間的近距離力：氫鍵、范德華力、靜電力、疏水作用力。兩者的距離越近，結(jié)合的位點(diǎn)越多，形成的近距離力也越大，結(jié)合的也越牢固。這些作用力在生理狀態(tài)下最大。由于抗原抗體反應(yīng)是分子表面的非分子結(jié)合，所形成的復(fù)合物并不牢固，可以隨時(shí)解離，解離的抗原抗體保持原來的生物活性，可與其它的抗原抗體再一次結(jié)合，在整個(gè)反應(yīng)體系中形成動(dòng)態(tài)平衡，平衡式為：Ag+Ab≒AgAb。這種平衡受到溫度、pH等物理的、化學(xué)的因素的影響。當(dāng)溫度大于60℃，pH值降到3以下時(shí)，由于同離子效應(yīng)等因素，使抗原抗體蛋白質(zhì)的近距離力遭到破壞，結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致抗原抗體復(fù)合物重新解離。

1.2.3 抗原抗體的總量 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)中所形成的沉淀線的粗細(xì)、清晰度與抗原抗體的量成正比例關(guān)系?？乖磸?fù)凍溶以及長(zhǎng)期把它放在室溫下都使大量的抗原破裂失去活性。所以在保存與運(yùn)輸抗原時(shí)應(yīng)放在冷凍條件下進(jìn)行。

1.3 抗原抗體本身其他因素

影響瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果的抗原抗體因素還包括抗原抗體的純度。抗原與其對(duì)應(yīng)的抗體的反應(yīng)屬于特異性反應(yīng)。但是如果兩者含有過多與反應(yīng)無關(guān)的蛋白質(zhì)、類脂質(zhì)、多糖等非特異性物質(zhì)，往往抑制抗原抗體的特異性反應(yīng)，而出現(xiàn)一些非特異性反應(yīng)。

2 瓊脂因素

瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的結(jié)果在很大程度上也受到瓊脂的成份、瓊脂板厚度、瓊脂的濃度、實(shí)驗(yàn)用水質(zhì)量、pH值、電解質(zhì)濃度、抗原抗體孔間距離及瓊脂水分的影響。

2.1 瓊脂的成份

影響瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果的瓊脂成份因素主要是不溶性雜質(zhì)。一些大的不溶性雜質(zhì)能直接堵塞瓊脂的網(wǎng)格，這樣的雜質(zhì)過多會(huì)影響抗原抗體的擴(kuò)散，為了避免雜質(zhì)的影響，應(yīng)在瓊脂粉融化后用脫脂棉或紗布過濾。

2.2 瓊脂板的厚度

瓊脂板的厚度應(yīng)為3mm，因?yàn)橛捎谥亓ψ饔?，加入孔中的抗原抗體會(huì)發(fā)生沉淀，導(dǎo)致上下層的濃度形成差，濃度大的向瓊脂網(wǎng)格中擴(kuò)散的速度要比濃度小的快，同時(shí)又由于抗原抗體的質(zhì)量與體積的差異，所以兩者形成的濃度差是不同的，擴(kuò)散速度的差異也不同，如果瓊脂板很厚，同一孔上下層擴(kuò)散速度差異及抗原抗體之間擴(kuò)散速度的差異都很大，致使抗原抗體孔之間形成的沉淀線上下層之間就不在同一平面上，影響瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的結(jié)果的觀察；相反如果瓊脂板太薄，所加的抗原抗體量很小，沉淀線不清晰甚至不出現(xiàn)沉淀線。

2.3 瓊脂的濃度

瓊脂凝膠網(wǎng)格允許通過物質(zhì)的最大分子量與瓊脂濃度成反比見附表(吳冠蕓等，1999)。卵黃抗體IgY的分子量為1.8×105(楊婷婷等，2000)，1%~1.5%的瓊脂溶液網(wǎng)格能允許絕大多數(shù)大分子抗原自由擴(kuò)散，大于這個(gè)濃度范圍的瓊脂網(wǎng)格太小不利于大分子抗原如雞馬立克氏病病毒(分子量為1.03×108)、雞傳染性喉氣管炎病毒(殷震等，1997)的擴(kuò)散，濃度太小瓊脂骨架太少不利于抗原抗體復(fù)合物的沉淀，從而影響瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的結(jié)果。

附表 瓊脂糖凝膠Bio-Gel A型的數(shù)據(jù)

型號(hào)A-0.5mA-1.5mA-5mA-15mA-50mA-150m 瓊脂糖含量%1086421 分級(jí)范圍(球蛋白)1×104~5×1051×104~1.5×1061×104~5×1064×104~1.5×1071×105~5×1071×106~1.5×108

2.4 試驗(yàn)用水的質(zhì)量

瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的結(jié)果在很大程度上也受到試驗(yàn)用水的影響。如果試驗(yàn)用水中含大量重金屬離子如鉛、汞、銅等，會(huì)使蛋白質(zhì)成份的抗原抗體變性失去活性，不能再發(fā)生特異性反應(yīng)，影響瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的結(jié)果。

2.5 pH值

抗原抗體大部分是蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)在一定的pH處所帶的凈電荷數(shù)為零，此時(shí)的pH值為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，大部分蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在pH5~5.5之間，在等電點(diǎn)處，蛋白質(zhì)分子之間靜電斥力減少，趨于凝集狀態(tài)而發(fā)生沉淀，所以蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)處的溶解度最低。當(dāng)瓊脂的pH在抗原抗體等電點(diǎn)處時(shí)，抗原抗體會(huì)發(fā)生非特異性的沉淀，影響瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。一般瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的pH為6~8(比等電點(diǎn)稍高)(余傳霖等，1998)。當(dāng)pH小于3時(shí)，往往使抗原抗體結(jié)合物變性或再次解離，如IgY在pH4.0~11.0穩(wěn)定，馬立克氏病毒在pH3或pH11處理10min失活。

2.6 電解質(zhì)的濃度

電解質(zhì)的濃度對(duì)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的結(jié)果影響也很大?？乖贵w具有膠體性質(zhì)，含有氨基、羧基、肽鏈等極性基團(tuán)，與水相互結(jié)合，形成水化層，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)帶有相同的電荷，所以膠體所帶電荷相同，互相排斥，在水中穩(wěn)定存在，抗原抗體帶有相反的極性，等兩者結(jié)合后，表面的電荷減少或消失，水化層也減弱，由親水型變?yōu)槭杷?，此時(shí)如有適當(dāng)濃度的電解質(zhì)，能進(jìn)一步降低抗原抗體表面的電荷，促進(jìn)他們沉淀，最常用的電解質(zhì)為氯化鈉，哺乳動(dòng)物血清學(xué)反應(yīng)濃度為0.15mol，即生理鹽水，禽類8%(楊廷彬等，1994)。但過高濃度的電解質(zhì)反而不利于抗原抗體沉淀物的形成，有兩個(gè)原因：（1）過高濃度的電解質(zhì)阻止蛋白質(zhì)與水分子的相互作用，破壞蛋白質(zhì)表面的水化層，產(chǎn)生鹽析效應(yīng)，使抗原抗體發(fā)生非特異性的沉淀。（2）過高濃度的電解質(zhì)濃度(大于或等于15%)可使抗原抗體結(jié)合物離解。

2.7 抗原抗體孔間距離

抗原抗體的孔間距離也能影響瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的結(jié)果。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)是利用可溶性的抗原抗體在瓊脂凝膠所形成的網(wǎng)格中自有擴(kuò)散，形成濃度梯度，在適當(dāng)濃度處相互結(jié)合，形成沉淀線。當(dāng)兩者之間的孔距為3mm時(shí)，抗原抗體既能形成合適的濃度梯度又能充分結(jié)合。當(dāng)兩者的孔間距離過大時(shí)，雖然能形成合適的濃度梯度，但由于抗原抗體量太少卻不能充分結(jié)合，相反孔距太小，雖然結(jié)合的量很大卻不能形成合適的濃度梯度，都能影響瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的結(jié)果。

2.8 瓊脂水分

瓊脂凝膠網(wǎng)格內(nèi)含有大量水分，如果瓊脂板儲(chǔ)存時(shí)間太長(zhǎng)或儲(chǔ)存環(huán)境太干燥又沒有放在密閉環(huán)境中，水分就會(huì)大量的揮發(fā)，直接影響抗原抗體擴(kuò)散的效果。

3 放置條件

一些培養(yǎng)條件如放置溫度、放置濕度、放置時(shí)間也是影響瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果的重要因素。

3.1 放置溫度

影響瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果的溫度因素包括:放置溫度的高低與放置溫度波動(dòng)情況。

3.1.1 放置溫度的高低 抗原抗體的反應(yīng)速度、結(jié)合程度與反應(yīng)溫度高低有密切關(guān)系，溫度高，分子運(yùn)動(dòng)加快，增加抗原抗體碰撞幾率，反應(yīng)會(huì)加快，但當(dāng)溫度超過56℃時(shí)反應(yīng)速度反而變慢，溫度再高，抗原抗體復(fù)合物往往會(huì)重新解離，甚至?xí)黄茐?，例如卵黃抗體在≥65℃情況下性質(zhì)就會(huì)變得不穩(wěn)定，雞馬立克氏病毒從感染雞皮膚中制備的脫離細(xì)胞制劑在56℃處理30min或在60℃處理10min都能失活，傳染性法氏囊病病毒在70℃處理30min失活(殷震等，1997)。反應(yīng)溫度低時(shí)，反應(yīng)速度變慢，但抗原抗體結(jié)合完全，沉淀量增多，結(jié)果清晰。但溫度過低，反應(yīng)無法進(jìn)行，也不會(huì)出現(xiàn)結(jié)果。最適的反應(yīng)溫度為37℃(楊廷彬等，1994)。

3.1.2 放置溫度的波動(dòng)情況 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的培養(yǎng)溫度應(yīng)恒定，如果波動(dòng)太大，會(huì)使抗原抗體在擴(kuò)散時(shí)形成不連續(xù)的濃度梯度，影響兩者產(chǎn)生最適比，最終影響到試驗(yàn)結(jié)果。

3.2 空氣濕度

瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)是抗原抗體在瓊脂網(wǎng)格中的水中擴(kuò)散時(shí)形成的，如果空氣中濕度太低，瓊脂中的水分很容易蒸發(fā)，使瓊脂網(wǎng)格中的水分減少，不利于抗原抗體的自由擴(kuò)散，同時(shí)加到瓊脂孔中的抗原抗體的水分也很容易蒸發(fā)，使卵黃中的抗體及抗體被固定在孔中不容易向瓊脂凝膠中擴(kuò)散。所以在培養(yǎng)時(shí)，往往倒置平皿，然后放在一個(gè)有濕棉紗布的有蓋搪瓷盤中，以防水分蒸發(fā)。

3.3 放置時(shí)間

瓊脂擴(kuò)散的結(jié)果也受到放置時(shí)間的影響。抗原抗體在瓊脂中的擴(kuò)散需要一定時(shí)間。如果放置時(shí)間太短，使抗原抗體沒有完全擴(kuò)散以致結(jié)合的不充分或結(jié)合后還沒有達(dá)到沉淀的程度，導(dǎo)致本應(yīng)形成的沉淀線沒有出現(xiàn)。時(shí)間太長(zhǎng)，在室溫條件小，大量抗原抗體會(huì)失去生物活性，已經(jīng)形成的沉淀帶發(fā)生解離消失而出現(xiàn)假像。

4 其他因素

抗原抗體加的多少、打孔后瓊脂底部融封效果都能影響瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的結(jié)果，當(dāng)抗原抗體的量加的多時(shí)，所產(chǎn)生的沉淀線粗，為了減小各個(gè)實(shí)驗(yàn)的相對(duì)誤差，加樣時(shí)，都應(yīng)加到滿而不溢程度。此外，打孔后瓊脂板底部松動(dòng)，如果不加熱封好，在實(shí)驗(yàn)過程中，抗原抗體就不通過瓊脂網(wǎng)格擴(kuò)散，而是直接在底部流出，不會(huì)產(chǎn)生沉淀線。

總之，瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)?zāi)苡行У闹笇?dǎo)養(yǎng)殖戶、獸醫(yī)工作者制定合理的免疫程序，但是由于受到諸多因素的影響，因此，為了得出真實(shí)的試驗(yàn)結(jié)果，操作者應(yīng)本著科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度進(jìn)行操作，以克服不良因素的影響。

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（2012–08–07）

S852.4+3

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1007-1733(2012)11-0080-03