桑腸桿菌VL4-3轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)香蘭素

喻林,魏敏,陳義坤,羅誠浩,宋旭艷,王潔,陳勇

(1.湖北大學(xué)中藥生物技術(shù)省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430062；2.湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心,湖北 武漢 430040)

香蘭素(Vanillin)又名香草醛,化學(xué)名為3-甲氧基-4-羥基苯甲醛.是一種以奶油香草為特征的風(fēng)味物質(zhì),廣泛用于冰淇淋、巧克力、乳制甜點(diǎn)、奶油糖果、焙烤食品、豆奶、可樂飲料和煙酒等食品制造中[1].香蘭素年用量很大,多數(shù)為化學(xué)合成[2],其中以愈創(chuàng)木酚和木質(zhì)素為原料合成的香蘭素為主[3].天然香蘭素主要是從香莢蘭豆莢中提取,由于香莢蘭植物的種植受地域和氣候環(huán)境的限制,產(chǎn)量極少,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場的需求[4].但是大多數(shù)化學(xué)合成的香蘭素在純度、香氣、安全性等方面都亞于天然提取的香蘭素,并且化學(xué)工藝產(chǎn)生的廢棄物對(duì)環(huán)境存在很大危害.近年來,美國和歐洲的法律認(rèn)可采用生物活細(xì)胞或其中的組成部分所生產(chǎn)的物質(zhì)為天然產(chǎn)物[5].因此,利用微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)天然香蘭素成為目前的研究熱點(diǎn)[6].本實(shí)驗(yàn)室從香莢蘭莖中篩選得到的一株桑腸桿菌VL4-3,并首次發(fā)現(xiàn)其能轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)香蘭素,對(duì)其發(fā)酵轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)香蘭素的發(fā)酵工藝進(jìn)行了研究.

1 材料與方法

1.1菌種與培養(yǎng)基桑腸桿菌VL4-3：從香莢蘭植物的莖中篩選得到,并經(jīng)過生理生化分析、16SrDNA擴(kuò)增和序列分析鑒定為桑腸桿菌(Enterobactermori).斜面培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)：馬鈴薯浸液200 mL/L,葡萄糖20 g/L,瓊脂13 g/L.原始種子培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)：牛肉膏5 g/L,蛋白胨10 g/L,氯化鈉5 g/L.發(fā)酵原始培養(yǎng)基(高氏一號(hào)培養(yǎng)基)：可溶性淀粉20 g/L,KNO31 g/L,NaCl 0.5 g/L,K2HPO40.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,FeSO4·7H2O 0.01 g/L.麥芽糖蛋白胨培養(yǎng)基：麥芽糖50 g/L,蛋白胨10 g/L,氯化鈉5 g/L.

1.2試劑與儀器試劑：甲醇(色譜純)；冰乙酸(分析純)；香蘭素(Sigma-Aldrich 公司,99.99%)；阿魏酸(陜西森弗生物技術(shù)有限公司,98%)及其儲(chǔ)備液(稱取一定量的阿魏酸,在熱水中加熱至完全溶解,用1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)pH到7.0,定容到30 g/L,然后用過濾法滅菌,4 ℃避光保存).香蘭素(Sigma-Aldrich 公司,99.99%). 儀器：Aglient 1100 高效液相色譜儀,柜式恒溫?fù)u床(武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限公司,HQL 300 B),無菌操作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司,SW-CJ-1FD).

1.3培養(yǎng)方法初始種子液培養(yǎng)方法：用接種環(huán)挑取一環(huán)L4-3到裝有200 mL液體種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,30 ℃,150 r/min培養(yǎng)24 h.

初始發(fā)酵方法：將L4-3菌種以10%(V/V)的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中,30 ℃,150 r/min培養(yǎng)24 h,加入2.7 g/L的阿魏酸,30 ℃,150 r/min培養(yǎng)12 d.

1.4樣品含量測定方法取一定量的發(fā)酵液,按1∶4的比例加入甲醇,震蕩30 min,11 000 r/min離心5 min取上清,0.22 μm濾膜過濾(過濾時(shí)棄掉首先濾出的3 mL).經(jīng)上述處理的發(fā)酵液用高效液相色譜檢測香蘭素含量,色譜條件為：Agilent Eclipse XDB-C8色譜柱 (5 μm,4.6 mm*150 mm),甲醇/0.5%冰乙酸(30/70,V/V)流動(dòng)相,流速 1 mL/min,檢測波長280 nm,進(jìn)樣量 10 μL,檢測時(shí)間 40 min.用50%甲醇溶液配制1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液,稀釋成一系列不同濃度,每次進(jìn)樣10 μL,以峰面積對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度作圖,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.香蘭素濃度和摩爾轉(zhuǎn)化率計(jì)算方法為：C香蘭素=(A香蘭素峰面積-23.948)/40.989；摩爾轉(zhuǎn)化率/%=(n香蘭素/n阿魏酸)×100.

2 結(jié)果及分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響

2.1.1 碳源對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響 以高氏一號(hào)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,固定氮源和無機(jī)鹽,分別以淀粉、葡萄糖、蔗糖、D-果糖、麥芽糖、麥芽浸粉、麩皮和谷殼作為碳源,濃度均為20 g/L,考察不同碳源對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響.由圖1可知,不同碳源對(duì)香蘭素產(chǎn)量影響由高到低依次是谷殼、麩皮、蔗糖、淀粉、麥芽浸粉、麥芽糖、葡萄糖和果糖.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明緩效碳源(麩皮和谷殼)比速效碳源更易于桑腸桿菌VL4-3將阿魏酸轉(zhuǎn)化為香蘭素,這可能是由于緩效碳源中含有微生物生長所必需的生長因子(硫胺素、核黃素、尼克酸等)、多糖(戊聚糖)等[7-8],故選擇麩皮作為桑腸桿菌VL4-3產(chǎn)香蘭素的最佳碳源.

2.1.2 氮源對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響 以高氏一號(hào)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,固定碳源和無機(jī)鹽,分別以酵母粉、黃豆餅粉、牛肉膏、大豆蛋白胨、動(dòng)物蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、磷酸銨和豆粕作為氮源,濃度均為1 g/L,考察不同氮源對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響.由圖2可知,不同氮源對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響由高到低依次是豆粕、黃豆餅粉、牛肉膏、動(dòng)物蛋白胨、酵母粉、大豆蛋白胨、硝酸鉀、硫酸銨、硝酸銨、磷酸銨.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明以豆粕、硝酸銨、牛肉膏、酵母粉和硝酸鉀為氮源時(shí)香蘭素產(chǎn)量較高,但考慮到生產(chǎn)成本和產(chǎn)物香蘭素的天然性,選擇豆粕作為桑腸桿菌VL4-3產(chǎn)香蘭素的最佳氮源.

圖2 不同氮源對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響

圖3 不同無機(jī)鹽離子對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響

2.1.3 無機(jī)鹽離子對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響 以高氏一號(hào)培養(yǎng)基為基礎(chǔ),固定碳源和氮源,分別以 Na2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、K2HPO4、CaCl2作為無機(jī)鹽,濃度均為0.5 g/L,考察不同無機(jī)鹽對(duì)香蘭素的影響.由圖3可知,磷酸氫鹽不利于菌種轉(zhuǎn)化阿魏酸生成香蘭素,而硫酸鹽利于香蘭素的產(chǎn)生,其中以FeSO4·7H2O為無機(jī)鹽時(shí)香蘭素的產(chǎn)量最高,故選擇FeSO4·7H2O作為桑腸桿菌VL4-3轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)香蘭素的最佳無機(jī)鹽.

2.1.4 最佳碳源氮源和無機(jī)鹽相對(duì)含量的確定-正交試驗(yàn) 選取L9(34)正交表,對(duì)影響香蘭素產(chǎn)量的碳源(麩皮)、氮源(豆粕)和無機(jī)鹽(硫酸亞鐵)的添加量進(jìn)一步做正交試驗(yàn),其因素和水平見表1,分析結(jié)果見表2.由表2的方差分析可見,3個(gè)因素對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響順序?yàn)榱蛩醽嗚F>麩皮>豆粕,即硫酸亞鐵的用量對(duì)香蘭素產(chǎn)量影響最大,豆粕用量對(duì)香蘭素產(chǎn)量影響最小.根據(jù)表2的結(jié)果可知最佳組合為麩皮10 g/L,豆粕1 g/L,硫酸亞鐵0.5 g/L.

表1 正交設(shè)計(jì)因素和水平表

表2 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)表及結(jié)果

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)條件對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響

2.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響 使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基,考察培養(yǎng)基的不同初始pH值對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響.由圖4可以看出,初始培養(yǎng)基pH在3～5時(shí)香蘭素的產(chǎn)量較低,初始培養(yǎng)基pH在6～10時(shí)香蘭素的產(chǎn)量相對(duì)較高,說明初始培養(yǎng)基在中性及偏堿性條件下更有利于桑腸桿菌VL4-3將阿魏酸轉(zhuǎn)化為香蘭素,且當(dāng)pH值為8時(shí)香蘭素的濃度最高,故選用pH 8作為發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳pH值.

圖4 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響

2.2.2 發(fā)酵溫度對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響 使用優(yōu)化的培養(yǎng)基(pH=8.0),考察不同發(fā)酵溫度對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響.由圖5可以看出,當(dāng)溫度在30～37 ℃之間時(shí),香蘭素的產(chǎn)量逐漸升高；當(dāng)溫度在37～40 ℃時(shí),香蘭素的產(chǎn)量顯著降低.且當(dāng)溫度在37 ℃時(shí),發(fā)酵液中的香蘭素濃度最高,故以37 ℃作為菌種轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)香蘭素的最佳發(fā)酵溫度.

2.2.3 接種量、阿魏酸添加量和阿魏酸添加時(shí)間對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響 在上述優(yōu)化的培養(yǎng)條件下,選取L9(34)正交表,考察菌種接種量、底物添加量和底物添加時(shí)間對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響.試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見表3,試驗(yàn)結(jié)果方差分析見表4.結(jié)果表明,3個(gè)因素對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響順序?yàn)榘⑽核峒尤肓?阿魏酸加入時(shí)間>菌種接種量,三因素最佳組合為菌種接種量為10%,底物添加量為8.5 g/L,底物添加時(shí)間為24 h.

表3 正交設(shè)計(jì)因素和水平表

表4 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)表和結(jié)果分析

2.2.4 搖瓶裝液量和轉(zhuǎn)速對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響 轉(zhuǎn)速和搖瓶裝液量是影響溶氧及氧化還原反應(yīng)的兩個(gè)重要因素.在上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件和固定轉(zhuǎn)速(100 r/min)情況下,考察了裝液量對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響.由圖6可以看出,當(dāng)裝液量大于容器容積10%時(shí),發(fā)酵液中香蘭素的濃度均明顯降低,故實(shí)驗(yàn)選用10%的裝液量(500 mL三角瓶中加入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基).在上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下和固定裝液量(容器容積的10%)情況下,考察搖床轉(zhuǎn)速對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響.由圖7可以看出,隨著轉(zhuǎn)速的增加,香蘭素的產(chǎn)量降低,當(dāng)發(fā)酵轉(zhuǎn)速為100 r/min時(shí),發(fā)酵液中香蘭素的濃度最高,故實(shí)驗(yàn)選用100 r/min為發(fā)酵轉(zhuǎn)速.

2.2.5 發(fā)酵過程光照/避光對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響 由于香蘭素和阿魏酸在光照條件下易分解,因此我們考察光照發(fā)酵和避光發(fā)酵對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響.由圖8可以看出,在避光發(fā)酵條件下香蘭素的產(chǎn)量更高,因此桑腸桿菌VL4-3轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)香蘭素更適合在避光條件下進(jìn)行.

2.3 種子培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.3.1 種子液的培養(yǎng)溫度對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響 以上述優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)條件下,考察種子培養(yǎng)溫度對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響,結(jié)果見圖9.隨著種子液的培養(yǎng)溫度增加,香蘭素產(chǎn)量逐漸降低,故實(shí)驗(yàn)選用25 ℃作為種子培養(yǎng)的最佳溫度.

圖6 搖瓶裝液量對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響

圖7 發(fā)酵轉(zhuǎn)速對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響

圖8 光照條件對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響

圖9 種子培養(yǎng)溫度對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響

2.3.2 種子培養(yǎng)基對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響 考察高氏一號(hào)培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽糖蛋白胨培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響,結(jié)果見圖10.由于高氏一號(hào)培養(yǎng)基的營養(yǎng)貧乏,種子液中的菌種繁殖較慢,導(dǎo)致接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中的菌種量少,因而得到的香蘭素濃度較低.牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和麥芽糖蛋白胨培養(yǎng)基中營養(yǎng)充足,但后者相對(duì)前者發(fā)酵液中香蘭素濃度更高,因此選擇麥芽糖蛋白胨培養(yǎng)基作為該菌種轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)香蘭素的種子培養(yǎng)基.

2.3.3 種子液的轉(zhuǎn)速對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響 種子液培養(yǎng)轉(zhuǎn)速能影響菌種的數(shù)量,因此考察種子液培養(yǎng)轉(zhuǎn)速分別為100、150、200 r/min時(shí)對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響,結(jié)果見圖11.在100 r/min時(shí)香蘭素的產(chǎn)量最高,150 r/min時(shí)香蘭素的產(chǎn)量最低,故選擇100 r/min作為種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)轉(zhuǎn)速.

圖10 種子培養(yǎng)基對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響

圖11 種子液培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響

圖12 底物加入量對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響

2.4底物最大加入量由于阿魏酸對(duì)菌種有一定的毒性,因此菌種對(duì)阿魏酸的耐受程度直接影響發(fā)酵液中香蘭素的濃度.在接種24 h后,我們分別考察底物加入量對(duì)香蘭素產(chǎn)量的影響.圖12是不同底物添加量培養(yǎng)12 d時(shí)香蘭素的含量測定結(jié)果.當(dāng)阿魏酸加入量在5.00 ～10.00 g/L之間,香蘭素產(chǎn)量升高,當(dāng)阿魏酸加入量在10.00～13.33 g/L之間時(shí),香蘭素的產(chǎn)量呈遞減趨勢.因此選用10 g/L的阿魏酸作為該菌種的最大耐受量.

2.5優(yōu)化結(jié)果的驗(yàn)證經(jīng)優(yōu)化得到VL4-3轉(zhuǎn)化阿魏酸生成香蘭素的最佳發(fā)酵條件如下.

液體發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基：麩皮10 g/L,豆粕1 g/L,氯化鈉0.5 g/L,硫酸亞鐵0.5 g/L,pH=8；最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件：接種量10%,搖瓶裝液量 10%,阿魏酸最大加入量 10 g/L,37 ℃,100 r/min,避光培養(yǎng)12 d；最佳種子培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；最佳種子培養(yǎng)條件：25 ℃,100 r/min,24 h.

用以上的優(yōu)化條件,進(jìn)行了3次重復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn),得到香蘭素的濃度為2 262.43 mg/L,轉(zhuǎn)化率達(dá)到28.87%.比優(yōu)化前香蘭素濃度(29.6 mg/L)提高了76.43倍,轉(zhuǎn)化率提高了11.4倍.

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化后,桑腸桿菌VL4-3將阿魏酸轉(zhuǎn)化為香蘭素的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為麩皮10 g/L,豆粕1 g/L,氯化鈉0.5 g/L,硫酸亞鐵0.5 g/L,pH=8.0；種子液培養(yǎng)基組成為麥芽糖50 g/L,蛋白胨10 g/L,氯化鈉5 g/L.種子液的培養(yǎng)條件為25 ℃、100 r/min轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24 h.在容器裝液量為10%的發(fā)酵培養(yǎng)基中接種10%的VL4-3種子液,培養(yǎng)24 h,加入10 g/L的阿魏酸,37 ℃、100 r/min轉(zhuǎn)速避光培養(yǎng)12 d,發(fā)酵液中香蘭素的濃度達(dá)到2 262.43 mg/L,轉(zhuǎn)化率達(dá)到28.87%.

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