基于液滴微流控芯片的單細(xì)胞分離

洪龍燁,郭峰,國世上,趙興中

(武漢大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,人工微結(jié)構(gòu)教育部重點實驗室,湖北 武漢 430072)

微流控芯片(又稱微全分析系統(tǒng)或芯片實驗室),現(xiàn)在已經(jīng)廣泛用于化學(xué)合成、生物化學(xué)分析、藥物篩選、DNA測序等領(lǐng)域.微流控系統(tǒng)能夠?qū)缀跽麄€化學(xué)室的功能,包括采樣、稀釋、進樣、反應(yīng)、分離和檢測等集成在可重復(fù)使用的微芯片上,具有高通量、高靈敏度、低試劑量消耗、無交叉污染、反應(yīng)速度快和易于集成化等諸多優(yōu)點[1].生物系統(tǒng)是非常復(fù)雜的,即使是同類的細(xì)胞彼此之間也是千差萬別的.針對單個細(xì)胞的差異性的分析試驗中,單細(xì)胞操控將是關(guān)鍵問題.高效的單細(xì)胞操控技術(shù)往往成本比較昂貴,在常規(guī)實驗中難以實現(xiàn).比如,臨床腫瘤樣本總是細(xì)胞總量少,但又極具研究價值.所以如何將其收集并進行有效的單細(xì)胞的分析是一個很有科學(xué)價值和挑戰(zhàn)性的課題[2-3].

目前流式細(xì)胞儀(flow cytometry)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于細(xì)胞分離和檢測,其可以對104以上數(shù)量的細(xì)胞進行有效的操作.但是流式細(xì)胞儀昂貴,體積龐大,需要專門技術(shù)人員操作,很難在醫(yī)院和實驗室進行廣泛的應(yīng)用.微流控芯片具成本低廉、體積微小、操作簡單、樣品消耗少等特點,可以更好地適合102～105細(xì)胞的操作和分離[4],可以非常好地克服上述局限,并可以實現(xiàn)類似儀器的小型化、集成化、便攜帶化和自動化.微流控芯片尺寸在微米級和細(xì)胞大小相當(dāng),非常適合用于細(xì)胞的物理操控以及相關(guān)生化反應(yīng)操作[5].以微流控芯片為平臺的細(xì)胞分離技術(shù)主要有兩類：一是根據(jù)采集到信號(熒光、散射光或者阻抗)的有無或者強弱為判斷標(biāo)準(zhǔn)施加外部操控措施進行篩選；二是按照細(xì)胞本身特定的物理化學(xué)特性(大小、介電常數(shù))在不同電場驅(qū)動作用下進行篩選.美國加州理工大學(xué)的學(xué)者開發(fā)了一種基于熒光誘發(fā)細(xì)胞分選的微流控芯片,他們首先對待分選的細(xì)胞進行熒光標(biāo)記,然后利用多層PDMS制作的微閥對以激光激發(fā)出的熒光信號的有無和強弱為檢測信號來控制細(xì)胞流向,成功地實現(xiàn)了對表達(dá)和沒有表達(dá)綠色熒光蛋白的大腸桿菌進行分選.光鑷分選也可以用于激光誘導(dǎo)熒光激發(fā)細(xì)胞的分選.在這種細(xì)胞分選過程中,包在鞘流中的單個細(xì)胞在488 nm激光束的照射下,通過綠色熒光蛋白表達(dá)發(fā)出熒光,經(jīng)光電倍增管轉(zhuǎn)換為電信號進入計算機處理,當(dāng)光強達(dá)到計算機所設(shè)范圍時,近紅外激光啟動光鑷作用,細(xì)胞流動方向發(fā)生偏轉(zhuǎn),目標(biāo)細(xì)胞流向收集通道,非綠色熒光蛋白表達(dá)的細(xì)胞則未受到光鑷的作用而流向廢液通道[6].Gwards等設(shè)計了一種用PDMS和玻璃芯片制作的集成化細(xì)胞分選芯片,通過檢測不同細(xì)胞阻抗值的變化來實現(xiàn)分選[7],在玻璃芯片內(nèi)利用高分子化合物作為鹽橋,當(dāng)細(xì)胞通過鹽橋時,引起阻抗響應(yīng)變化,這種變化與細(xì)胞大小有關(guān),因此可以用于人的紅細(xì)胞和白細(xì)胞的分選.當(dāng)然還有磁力分選法,將特定的細(xì)胞表面抗原與包被在磁球上的特異性抗體結(jié)合,在外磁場作用下,含有特異性抗原的細(xì)胞會被吸附而停留在磁場中[8].

以上的實驗和操作多是在鞘流或有溝道的微流體芯片中進行的,與之相對比,液滴微流控芯片具有通量高、高靈敏度、無交叉污染、方便集成等特點,其為我們進行細(xì)胞操控和分析提供了一個強有力的平臺[3-4],很多技術(shù)有如光[9]、聲[10]、機械閥[11-12]、流體動力、磁[13]、電[4,14-17]等已經(jīng)應(yīng)用到基于液滴微流控芯片的單細(xì)胞操控中.相對于以上的物理手段,電學(xué)方法有步驟簡單、操作力強、無需特異性的標(biāo)記、反應(yīng)迅速等優(yōu)點.我們發(fā)展了一種利用靜電作用力和流體動力相結(jié)合的將單細(xì)胞分離形成微液滴并富集的方法.在實驗室前期對微液滴的研究中,我們驚奇地發(fā)現(xiàn)在對通常利用的流聚焦溝道產(chǎn)生的微量液滴未有任何其他額外操作的情況下,微量液滴表現(xiàn)出“自帶電”的獨特行為,并對微液滴的帶電量進行了進一步研究[17].受此啟發(fā),我們通過集成微電極的方法對包裹有單細(xì)胞的微液滴進行分離和篩選,改善了傳統(tǒng)液滴微流控技術(shù)收集單細(xì)胞液滴較少的問題.

1 實驗設(shè)計原理

在本文中,我們應(yīng)用帶有流聚焦溝道的微流控芯片來制備微液滴.連續(xù)相(油相)由左側(cè)的孔注入到芯片,分散相(水相)由左側(cè)第二個孔進入到芯片.水相被油相在十字型流聚焦縮口處被油相的剪切力夾斷,形成連續(xù)的液滴.當(dāng)微電極上沒有作用直流電壓時,所有的微液滴流動到流體阻力較小的左側(cè)的出口中.當(dāng)微電極作用上直流電壓,微液滴將受到靜電作用力的影響,全部被引導(dǎo)流向右側(cè)的廢物通道；隨著短時間內(nèi)停止直流電壓,含有單細(xì)胞的微液滴將只受到流體動力流向左側(cè)的收集通道,如圖1(a)所示.

2 微流控芯片制作

圖1 (a)單細(xì)胞被封進裝液滴以及液滴分離進入收集通道的示意圖 (b)基于微流控芯片設(shè)計圖

微流控芯片設(shè)計如圖1(b)所示,用標(biāo)準(zhǔn)光刻技術(shù)加工制備微流體芯片并將微電極用銀漿灌注方法集成于芯片中.我們先利用CorelDraw軟件設(shè)計出實驗所需圖樣,再交由專業(yè)打印機構(gòu)精確打印,從而得到掩膜.清洗好硅片后,在其表面均勻涂上一層黏性好、厚度適當(dāng)?shù)墓饪棠z后,進行曝光.將掩模置于光源與光刻膠之間,用紫外線等透過掩膜對光刻膠進行選擇性照射.在光照到的地方,光刻膠發(fā)生化學(xué)反應(yīng),從而改變感光部位膠的性質(zhì).把此曝光過的基片用顯影液除去應(yīng)去掉的部分光刻膠,獲得與掩模相同(正光刻膠)或相反(負(fù)光刻膠)的圖形.在我們的實驗中,采用的是AZ50正光刻膠,把顯影完的基片清洗后,在一定溫度下烘烤一段時間.在此光刻好的模板上澆注PDMS(聚二甲基硅氧烷)靜置0.5 h以上,使氣泡在重力作用下逸出.再將硅片放入電熱恒溫箱烘烤固化,進行切片,便得到了我們實驗所設(shè)計的PDMS基片.按實驗所設(shè)計圖樣用空心管切割法對PDMS基片打孔,和玻璃片一起經(jīng)過氧等離子處理,使得PDMS基片與潔凈的玻璃蓋片較好地鍵合在了一起,然后置于80 ℃的烘箱中烘烤兩到三天使芯片內(nèi)管道壁具有疏水性.最后再將銀漿灌注到事先切割好的PDMS槽中制成微電極.至此我們便制得了實驗所需的微流體芯片.

3 實驗操作和結(jié)果分析

圖2 單細(xì)胞微液滴的形成

圖3 (a)無細(xì)胞的微液滴或含有多個細(xì)胞的微液滴在靜電力的作用下直接進入廢物通道;(b)單細(xì)胞微液滴通過一個10 ms直流電壓的停頓被分離出來.

圖4 微液滴內(nèi)細(xì)胞數(shù)目的數(shù)據(jù)圖

3.1實驗操作步驟把2×106細(xì)胞配置在在1 mL PBS緩沖液中,將其以1∶1比例和3%的海藻酸鈉溶液相混合,充分混勻后作為分散相；把懸浮有細(xì)胞的海藻酸鈉溶液作為連續(xù)相分別加入到1 mL 注射器內(nèi),并在針頭上接好軟管,然后裝配到注射泵上；把芯片固定在顯微鏡的載物臺上；之后,將針頭上的軟管與芯片入口處的金屬管對接；調(diào)節(jié)注射泵流速,待油水兩相交匯并穩(wěn)定后,利用顯微鏡上的CCD進行拍攝.圖2所示即為通過CCD拍攝的單細(xì)胞微液滴的形成過程.通過控制油相和分散相的流速可以很好地控制液滴的大小或者產(chǎn)生頻率,通過控制細(xì)胞的密度來控制包裹在每個微量液滴中的細(xì)胞數(shù)量分布.

為了富集單細(xì)胞微液滴,用于篩選無細(xì)胞的海藻酸鈉微液滴、含有多個細(xì)胞的海藻酸鈉微液滴進入右側(cè)廢物通道的直流電壓達(dá)到400 V.在顯微鏡的觀察下,通過停止直流電壓一個較短時間(相當(dāng)于一個瞬間的低電壓脈沖),單細(xì)胞微液滴在流體動力的作用下直接進入左側(cè)收集通道,如圖3(a)、3(b)所示.

3.2結(jié)果分析和討論無細(xì)胞的海藻酸鈉微液滴、含有單細(xì)胞的海藻酸鈉微液滴、含有2個細(xì)胞的海藻酸鈉微液滴以及含有多個細(xì)胞的海藻酸鈉微液滴的數(shù)量比例如圖4所示.如圖所示,流聚焦方法得到的含有單細(xì)胞的海藻酸鈉微液滴不到總液滴數(shù)的10%.采用此種方法得到的含有單細(xì)胞的微液滴,在細(xì)胞懸液充分打散無團聚的情況下,液滴中的細(xì)胞數(shù)目和其微液滴數(shù)是按泊松分布的,其中含單細(xì)胞的微液滴數(shù)較少.本實驗,正是通過電分選的方法將這種數(shù)目較少的含有單細(xì)胞的微液滴篩選收集起來,從而達(dá)到富集的效果.

對于微液滴表現(xiàn)出的“自帶電”的獨特行為,由于微量液滴體積微小,不便于觀察操作,直接測量電學(xué)性質(zhì)相對還是比較困難的,因此到目前也沒有得出普遍接受的結(jié)論,猜測微量液滴帶電的原因可能是感應(yīng)帶電,或者由微滴與油流之間電子與離子的轉(zhuǎn)移帶電,或是兩者同時作用.如圖3所示實驗結(jié)果表明通過這種電學(xué)操控方法可以有效地篩選單細(xì)胞微液滴,并富集由流聚焦溝道產(chǎn)生的較少的單細(xì)胞微液滴,大大改善了傳統(tǒng)液滴微流控技術(shù)收集單細(xì)胞液滴較少的弊端.

4 結(jié)論

流聚焦結(jié)構(gòu)的微流控芯片提供了一種單分散性微液滴形成的方式.從上述實驗結(jié)果中可以看到,這種結(jié)合了流體動力的單細(xì)胞微液滴收集方法將會成為一種簡單有效的單細(xì)胞操控分析平臺；并且這種方法相比于直接用電篩選的方法,細(xì)胞更不易受到影響和破壞,從而將獲得細(xì)胞存活率較好的單細(xì)胞微液滴,更有利于后期有效的單細(xì)胞分析.

[1] 林炳承,秦建華. 微流控芯片實驗室[M]. 北京：科學(xué)出版社,2006:1-11.

[2] Schaerli Y, Hollfelder F. The potential of microfluidic water-in-oil droplets in experimental biology[J]. Molecular Biosystems, 2009, 5(12):1392-1404.

[3] Sims C E, Allbritton N L. Analysis of single mammalian cells on-chip[J]. Lab Chip, 2007, 7(4):423-440.

[4] Baret J C, Miller O J, Taly V, et al. Fluorescence-activated droplet sorting (FADS)：efficient microfluidic cell sorting based on enzymatic activity[J]. Lab Chip, 2009, 9(13):1850-1858.

[5] El-Ali J, Sorger P K, Jensen K F. Cells on chips[J]. Nature, 2006, 442(7101)：403-411.

[6] Wang M M, Tu E, Raymond D E,et al. Microfluidic sorting of mammalian cells by optical force switching[J]. Nat Biotech, 2005, 23(1)：83-87.

[7] Gawad S, Schild L, Renaud P. Micromachined impedance spectroscopy flow cytometer for cell analysis and particle sizing[J]. Lab Chip, 2001, 1(1)：76-82.

[8] Furdui V I, Harrison D J. Immunomagnetic T cell capture from blood for PCR analysis using microfluidic systems[J]. Lab Chip, 2004, 4(6)：614-618.

[9] He M Y, Edgar J S, Jeffries G D M, et al. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter and femtoliter-volume droplets[J]. Anal Chem, 2005,77(6):1539-1544.

[10] Franke T, Abate A R, Weitz D A, et al. Surface acoustic wave (SAW) directed droplet flow in microfluidics for PDMS devices[J]. Lab Chip, 2009, 9(18):2625-2627.

[11] Zeng S J, Li B W, Su X O, et al. Microvalve-actuated precise control of individual droplets in microfluidic devices[J]. Lab Chip, 2009, 9(10):1340-1343.

[12] Guo F, Liu K, Ji X H, et al. Valve-based microfluidic device for droplet on demand operation and static assay[J]. Appl. Phys. Lett., 2010, 97(23):233701.

[13] Zhao L B, Pan L, Zhang K, et al. Generation of Janus alginate hydrogel particles with magnetic anisotropy for cell encapsulation[J]. Lab Chip, 2009, 9(20):2981-2986.

[14] Ahn K, Kerbage C, Hunt T P, et al. Dielectrophoretic manipulation of drops for high-speed microfluidic sorting devices[J]. Appl Phys Lett, 2006, 88(2):024104.

[15] Fidalgo L M, Whyte G, Bratton D, et al. From microdroplets to microfluidics：selective emulsion separation in microfluidic devices[J]. Angew Chem, Int Ed, 2008, 47(11):2042-2045.

[16] Link D R, Grasland-Mongrain E, Duri A, et al. Electric control of droplets in microfluidic devices[J]. Angew Chem, Int Ed, 2006, 45(16):2556-2560.

[17] Guo F, Ji X H, Liu W, et al. Droplet electric separator microfluidic device for cell sorting[J]. Appl Phys Lett, 2010, 96(19)：193701.