三聚氰胺DNA適體的篩選研究

張 強

三聚氰胺DNA適體的篩選研究

張 強

為了篩選識別三聚氰胺的DNA適體，于體外合成ssDNA文庫并固相化于瓊脂糖凝膠顆粒表面，將液相中三聚氰胺將與其結(jié)合的DNA分子從固相表面分離，進(jìn)而建立非固相化SELEX技術(shù)，最終獲得了三聚氰胺識別適體，并采用DNAMAN和RNA Structure軟件對適體進(jìn)行了一、二級結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示，經(jīng)過10輪篩選，ssDNA文庫與三聚氰胺的親和力呈上升趨勢，隨機挑選的20個陽性克隆適體根據(jù)一級結(jié)構(gòu)的同源性可分為4個家族，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測以莖環(huán)結(jié)構(gòu)為主，表明篩選得到識別三聚氰胺的DNA適體。

三聚氰胺；適體；食品安全；檢測技術(shù)

小分子污染物問題已經(jīng)成為世界各國普遍關(guān)注的食品安全問題之一，近年來頻發(fā)的三聚氰胺食品安全事件讓人們意識到了此類問題的嚴(yán)重性，更使人們意識到發(fā)展針對小分子污染物的新型檢測技術(shù)的重要性[1]?；诤怂徇m體(一種新型分子識別元件)的檢測技術(shù)近年來發(fā)展迅速[2-3]。但是，核酸適體檢測技術(shù)才在食品安全領(lǐng)域剛剛起步，目前還沒有關(guān)于三聚氰胺核酸適體篩選和應(yīng)用的報道。本研究旨在采用小分子非固相化SELEX技術(shù)，篩選識別三聚氰胺的DNA適體，為三聚氰胺適體檢測技術(shù)的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 DNA序列

研究中所使用的DNA序列如表1所示，均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

表1 研究中使用的DNA序列

注：Library兩端是引物結(jié)合區(qū)，中間用來固定適體庫。N10和N20表示ssDNA庫的隨機區(qū)。

1.2 試劑與儀器

Thermo鏈霉親和素凝膠：南京生興公司；TaqMix：東盛生物公司；TA克隆試劑盒：北京康為世紀(jì)生物有限公司；DNA Marker：東盛生物公司；Trans 10感受態(tài)細(xì)胞：北京全式金生物技術(shù)有限公司；三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品：Augsburg公司；Sartorius；高速冷凍離心機：Thermo；微量紫外可見分光光度計：GE Helthcare；LB940多功能微孔板分析儀：德國Berthold；Costar 3915黑色96孔板：美國Costar公司；JS-680D全自動凝膠成像分析儀：上海培清科技有限公司。

1.3 SELEX篩選

(1)隨機適體庫的固定 第一輪：將2.0nmol ssDNA文庫、10.0nmol B-B以及2.5nmol P1和P2溶于200μl SB溶液(300mmol/L NaCl，50mmol/L KCl，10mmol/L MgCl2，50mmol/L Tris，pH8.3)后，90℃變性3min，4℃孵育過夜；第二輪及以后：根據(jù)實際投入ssDNA的量，按照ssDNA∶P1∶P2∶B-B為1∶1.5∶1.5∶5溶于200μl SB后，90℃變性3min，室溫退火30min。取200μl鏈親和素修飾的瓊脂糖凝膠于離心柱中，用SB洗滌5次，加入孵育過夜的溶液，在旋轉(zhuǎn)混合器上作用40min，然后將凝膠與液相離心分離。

(2)三聚氰胺洗脫特異性結(jié)合的ssDNA SB洗滌上述固定好的凝膠10次。用200μl 0.5mmol/L的三聚氰胺與固定好的ssDNA文庫在旋轉(zhuǎn)混合器上室溫孵育40min，然后將凝膠與液相離心分離，液相中的ssDNA即為篩選的目標(biāo)ssDNA。

(3)PCR擴(kuò)增 利用2×TaqMix進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增時上、下游引物分別為F-P3和P2-B，每輪對引物的添加量、模板的添加量和循環(huán)輪數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。

(4)dsDNA的拆分 將PCR擴(kuò)增得到的dsDNA與鏈霉親和素標(biāo)記的凝膠孵育，加入NaOH 200μl，在混合器上室溫孵育15min，使dsDNA堿變性解鏈，然后600g離心1min，收集濾液。

1.4 TA克隆與測序

按照北京康為世紀(jì)生物有限公司的TA克隆試劑盒的使用說明進(jìn)行，隨機挑選20個陽性克隆，送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序鑒定。

1.5 序列分析及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用DNAMAN軟件對篩選到的ssDNA進(jìn)行一級結(jié)構(gòu)序列比對，采用RNA structure軟件對ssDNA進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 每輪適體篩選的效率

圖1 每輪篩選的效率

本研究進(jìn)行了10輪的適體篩選，每輪的篩選效率如圖1所示。從圖1可以看出，在第2輪篩選時的篩選效率僅僅1.5%，隨著篩選輪數(shù)的增加，洗脫的ssDNA在逐步富集，篩選效率逐步增加；但在第10輪篩選時，篩選效率幾乎不再增加，此時篩選效率達(dá)到70.4%。

2.2 克隆測序及一級結(jié)構(gòu)

將第10輪的洗脫產(chǎn)物PCR擴(kuò)增后，利用試劑盒參照說明書進(jìn)行TA克隆。隨機挑取20個陽性克隆送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序鑒定(表2)。經(jīng)DNAMAN軟件分析，20個ssDNA序列分為4個家族(SS1、SS2、SS3、SS4)。

表2 篩選到的ssDNA序列

2.3 二級結(jié)構(gòu)

采用RNA structure軟件對SS1、SS2、SS3和SS4二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析(圖2)，可以看出，這4條序列的二級結(jié)構(gòu)主要以莖環(huán)結(jié)構(gòu)為主。SS1形成雙莖環(huán)，環(huán)中均含有1個“GTT”序列；SS2形成“Y“字結(jié)構(gòu)，其中長莖連接環(huán)及共同形成環(huán)中含有1個“GTT”序列；SS3和SS4中均含有1個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并且環(huán)中各有1個“GTT”序列；這些莖環(huán)可能是適體與三聚氰胺結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的莖可能起到穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的作用，環(huán)則直接與靶分子結(jié)合，具體的結(jié)合位點還不清楚。

圖2 ssDNA的二級結(jié)構(gòu)

3 討論

傳統(tǒng)的針對小分子物質(zhì)適體篩選的SELEX技術(shù)，通常采用固相化小分子的策略，對小分子的分子結(jié)構(gòu)具有一定要求，且篩選效果很難達(dá)到預(yù)期目的。本研究針對三聚氰胺核酸適體進(jìn)行篩選時，借鑒Nutiu等[4]報道的非固相化小分子的適體SELEX篩選策略，并將Nutiu等使用的放射性標(biāo)記的方法進(jìn)行改進(jìn)，采用熒光標(biāo)記的上游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過拆分獲得的次級庫是帶有熒光標(biāo)記的ssDNA，這樣就通過熒光檢測非常簡便地監(jiān)控篩選過程，避免了放射性的操作，并且可以通過比較篩選時投入和洗脫的ssDNA的熒光強度來估算適體篩選的效率。這種非固相化小分子的適體篩選策略省了小分子改造固定的過程，大大提高了適體的篩選效率，并且有可能同時篩選到針對單個靶分子的特異性適體和針對多個靶分子的廣譜型核酸適體。

[1]Ingelfinger J R.Melamine and the global implications of food contamination [J].The New England and Journal of Medicine,2008,359:2745-2748.

[2]Tombelli S,Mascini M.Aptamers biosensors for pharmaceutical compounds [J].Combinatorial Chemistry & High Throughput Screenin,2010,13:641-649.

[3]Weigand J E,Suess B.Aptamers and riboswitches:perspectives in biotechnology [J].Applied Microbiology and Biotechnology,2009,85:229-36.

[4]Nutiu R,Li Y.Invitroselection of structure-switching signaling aptamers [J].Angewandte Chemie,2005,117:1085-1089.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.07.013

R155

A

1673-1409(2012)07-S047-03

2012-07-02

中國博士后科學(xué)基金(20090451177)；江蘇省博士后科研資助項目(0802023B)。

張 強(1979-)，男，山東濟(jì)南人，博士，助理研究員，研究方向營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。

劉賢金，E-mail:jaasliu@jaas.ac.cn。