對(duì)氧磷酶2基因多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性研究

張慎韜，李東芳，張華屏，裴宇恒，連 霞，劉彩玉

對(duì)氧磷酶（paraoxonase，PON）是一種有機(jī)磷三酯化合物水解酶，該酶可水解、中和導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的特定脂質(zhì)過氧化物，保護(hù)細(xì)胞膜不被脂質(zhì)過氧化物破壞［1］。腦梗死作為一種血栓、動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)性疾病，在其發(fā)病過程中理論上可因PON2基因突變導(dǎo)致相應(yīng)酶的功能缺損而加劇腦梗死的進(jìn)程。近年研究表明，PON2S311C多態(tài)性與冠心?。?］、2型糖尿病有關(guān)［3］，與胃腸疾病相關(guān)［4］，但與腦梗死的相關(guān)性尚無確切定論。本研究旨在了解這一基因多態(tài)性在山西漢族人群的分布頻率，同時(shí)探討PON2基因多態(tài)性是否為腦梗死發(fā)病的危險(xiǎn)因素。本實(shí)驗(yàn)瀏覽人類單倍體圖計(jì)劃（HapMap）［5］，選取PON2標(biāo)簽SNP（tag SNPs）rs17876171單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行研究，探討該點(diǎn)突變導(dǎo)致的多態(tài)性與腦梗死發(fā)病的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2010年1月—2011年4月在山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的腦梗死患者及部分健康體檢人員的臨床資料和外周血標(biāo)本。對(duì)象均為山西地區(qū)漢族人，并簽署知情同意書。病例組：首發(fā)急性腦梗死患者110例，其中男65例，女45例；年齡（58.2±10.5）歲。研究對(duì)象均有完整的臨床資料，并符合1986年WHO腦卒中診斷標(biāo)準(zhǔn)以及1995年中華醫(yī)學(xué)會(huì)全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的《各類腦血管疾病診斷要點(diǎn)》，均經(jīng)頭顱MRI＋MRA＋DWI證實(shí)有新鮮的梗死灶及顱內(nèi)動(dòng)脈閉塞或狹窄。此外還排除了風(fēng)濕性心臟病、房顫、感染性心內(nèi)膜炎等可引起繼發(fā)性腦栓塞的情況，以及冠心病、心肌缺血、2型糖尿病。正常對(duì)照組：同期在我院接受健康體檢人群100名，其中男57名，女43名；年齡（56.85±11.33）歲。對(duì)照組的年齡、性別與病例組相匹配，并除外顱內(nèi)、外動(dòng)脈閉塞性病變、冠心病、心肌梗死、糖尿病等。

1.2 主要試劑及儀器 Taq DNA聚合酶、dNTP購自Fermentas公司；引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成；限制性內(nèi)切酶DdeI購自Fermentas公司；DL2000DNA Marker購自大連寶生物公司；主要儀器由美國Bio-Rad公司的PTC200型PCR擴(kuò)增儀、北京六一科技有限公司的垂直電泳槽、電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)等組成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本收集 所有被檢者均禁食12h～14h，晨起空腹抽取靜脈血4mL～5mL，EDTA抗凝。其中2mL置于-80℃保存，用作DNA提??；另3mL靜脈血分離血清測(cè)定三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和血糖水平，并且記錄入院時(shí)未服降壓藥時(shí)的血壓情況，詳細(xì)詢問有無吸煙史、飲酒史及腦卒中家族史。

1.3.2 DNA提取 按酚-氯仿抽提取法，提取外周血中白細(xì)胞內(nèi)的DNA，溶于TE溶液中，置-20℃冰箱保存。

1.3.3 PCR擴(kuò)增 所用引物序列參考文獻(xiàn)［3］，并由上海生工生物工程公司合成。上游引物5′-ggaaaacagggcttattgatga-3′，下游引物5′-ctgggtcaatgttgctggttaaa-3′。PCR反應(yīng)體系：包含1×PCR緩沖液（10mmol／L ris-HCl，50mol／L KCl，1.5mol／L MgCl2），200 μmol／L dNTP，上 下 游 引 物 各 100nmol／L，DNA200ng，Taq DNA聚合酶1U。反應(yīng)條件：94%預(yù)變性5 min，然后按94℃40s、50℃40s、72℃90s共35次循環(huán)，最后72℃至10min。PCR結(jié)束后取10μL PCR產(chǎn)物行20g／L瓊脂糖凝膠電泳（含0.5mL溴化乙錠），5V／cm電泳40min，在紫外燈下觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果。

1.3.4 酶切反應(yīng) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶DdeI消化后，行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，60V電泳1h～2h，最后經(jīng)0.5μg／mL溴化乙錠染色，直至DNA條帶顯色為止。拍照觀察、保存并分析結(jié)果。PON2產(chǎn)物片段總長度為331bp，經(jīng)內(nèi)切酶消化后，可出現(xiàn)3種片段的組合，分別為：128bp、105bp、67bp、31bp（CC 基 因 型）；172bp、128bp、31bp（GG 基 因 型）；172bp、128bp、105bp、67bp、31bp（CG基因型）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用Hardy-Weinberg（H-W）分析法，檢驗(yàn)兩樣本的群體代表性。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間均數(shù)比較應(yīng)用t檢驗(yàn)和方差分析。兩組間基因型及等位基因頻率比較采用卡方檢驗(yàn)。腦梗死的危險(xiǎn)因素使用非條件Logistic回歸方法分析。

2 結(jié) 果

2.1 H-W平衡分析結(jié)果 對(duì)SNPs rs17876171位點(diǎn)進(jìn)行擬合優(yōu)度檢驗(yàn)，腦梗死組（χ2=2.352）和對(duì)照組的（χ2=1.342），腦梗死組與對(duì)照組基因型及等位基因頻率分布沒有偏離H-W平衡（P＞0.05），表明兩組受檢者均來自于同一群體，達(dá)到遺傳平衡。

2.2 兩組受檢者的一般資料 腦梗死組和對(duì)照組年齡、性別、空腹血糖、飲酒史差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。但腦梗死組患者的吸煙史、收縮壓、舒張壓、卒中家族史、TC、TG、HDL-C、LDL-C，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.3 基因型和等位基因頻率分布 腦梗死組基因型和等位基因頻率分布與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。腦梗死組G等位基因頻率為20.4%，對(duì)照組為13.0%，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.14，P＜0.05）。攜帶G等位基因的基因型（GC＋GG）與CC基因型比值比OR=2.15（1.25～3.70）。詳見表2。2.4 多元Logistic回歸分析 將腦梗死組作為自變量，以上述檢驗(yàn)、方差分析和卡方檢驗(yàn)所得有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的TG、TC、HDL-C、LDL-C、收縮壓、舒張壓以及攜帶G等位基因的基因型作為因變量，經(jīng)過多元Logistic回歸分析顯示，收縮壓、TG、吸煙史、GC＋GG的回歸系數(shù)b為正值；而HDL-C為負(fù)值。詳見表3。

表2 兩組基因型頻率、等位基因頻率比較 例（%）

表3 Logistic回歸分析結(jié)果

3 討 論

本研究立足于山西地區(qū)人群，采用病例對(duì)照研究，選取PON2標(biāo)簽位點(diǎn)tagSNP rs17876171，探討該點(diǎn)突變（C→G）導(dǎo)致的基因多態(tài)性與腦梗死關(guān)系。本研究結(jié)果提示，腦梗死組PON2rs17876171位點(diǎn)G等位基因頻率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。腦梗死組攜帶G等位基因的GG、GC基因型與CC基因型的相對(duì)危險(xiǎn)度OR=2.15。經(jīng)多元非條件Logistic回歸分析顯示，TG的OR值為6.781，95%CI（2.663，17.266）；收縮壓的OR 值為1.426，95%CI（1.097，1.853）；吸煙史的OR值為1.988，95%CI（1.239，3.190）；GC＋GG的OR 值為2.179，95%CI（1.527，3.108）。因此，TG、血糖、收縮壓和攜帶G等位基因?yàn)槟X梗死的危險(xiǎn)因子。

PON是一類Ca2＋依賴性高密度脂蛋白相關(guān)脂酶，目前已發(fā)現(xiàn)有3個(gè)家族成員，包括PON1、PON2和PON3。PON2位于人類7號(hào)染色體長臂q21.3，包括9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子。該基因編碼區(qū)在2個(gè)位點(diǎn)具有多態(tài)性，分別是148位丙氨酸（alanine，A）／甘氨酸（glycine，G）和311位半胱氨酸（cysteine，C）／絲氨酸（serine，S）［6］。在梗死形成過程中，PON 可以防止氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）生成，水解脂質(zhì)過氧化物，并清除存在于ox-LDL中的致炎性氧化型脂質(zhì)，發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用［7］，進(jìn)而干預(yù)腦梗死的形成。最新研究表明PON2可以阻止線粒體內(nèi)過氧化物的形成以及抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步在分子水平闡述了PON2抗動(dòng)脈硬化的機(jī)制［8］。目前研究較多的是PON1基因，但相比PON1僅在肝臟中表達(dá)，PON2的表達(dá)更為廣泛，在多個(gè)組織中均有表達(dá)，并在動(dòng)脈壁細(xì)胞，包括上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞以及細(xì)胞核周、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中均被檢測(cè)出來［9，10］。研究發(fā)現(xiàn)PON2基因敲除后的小鼠，相對(duì)野生型小鼠體內(nèi)環(huán)境氧化壓力升高、炎性反應(yīng)加劇，動(dòng)脈粥樣硬化程度增大［7］。有學(xué)者認(rèn)為PON2可在細(xì)胞水平發(fā)揮抗氧化作用，與血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系更為密切，所以更具研究潛質(zhì)。

Slowik等［2］研究認(rèn)為PON2基因多態(tài)性與大血管病變有關(guān)，目前該基因與冠心病的相關(guān)性已有廣泛的研究，但其與腦血管疾病之間的關(guān)系尚未完全明確。一項(xiàng)研究中報(bào)道PON2 311CC基因型在存在冠狀動(dòng)脈三支病變的人群中有著比較高的頻率［11］，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示G基因型（PON2 311C）是腦梗死的危險(xiǎn)因素。這可能是由于腦梗死與冠心病的具有相同的發(fā)病機(jī)制，均是由動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展所致，所以出現(xiàn)該基因在腦梗死人群與冠心病人群中相同的結(jié)果。但本次的研究結(jié)果與英國學(xué)者Alireza等［6］的研究結(jié)論并不一致。這種差異可能源于等位基因出現(xiàn)的頻率不僅受到基因多態(tài)性間的連鎖不平衡影響，還存在著種族差異及環(huán)境等多因素的影響，且由于樣本數(shù)量有限所導(dǎo)致。

本研究結(jié)果提示山西漢族地區(qū)攜帶PON2S311CG等位基因的人群發(fā)生腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)增高。但尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量和采樣范圍，以進(jìn)一步證實(shí)該位點(diǎn)突變?cè)谀X梗死中的價(jià)值。期望通過檢測(cè)PON2 311位等位基因篩選腦梗死高危人群，為腦梗死的預(yù)警提供新的線索。

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