N-芐氧羰基-甘氨酸水飛薊賓單酯的合成及其抗氧化活性

劉 偉， 許賓賓， 曹樹(shù)穩(wěn)

(1. 伊犁師范學(xué)院 化學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，新疆 伊寧 835000； 2. 南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

水飛薊素是指從菊科藥用植物水飛薊種子的種皮中提取得到的一類黃酮木脂素[1]。水飛薊賓(1)作為其主要的活性成分不僅具有保肝利膽作用[2]，還具有明顯的清除自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抗癌和抗炎作用[3]。黃酮類化合物分子具有典型的親脂性弱特征，嚴(yán)重限制了其透過(guò)具有豐富脂質(zhì)小腸外膜的能力[4]，從而難以被胃腸道吸收進(jìn)入組織細(xì)胞，極大的限制了其臨床應(yīng)用，也給適應(yīng)性新藥的尋找與開(kāi)發(fā)帶來(lái)相當(dāng)大的困難。1的臨床應(yīng)用同樣也受到吸收性差，生物利用度低的限制。通過(guò)糖苷化、酯化和?；确椒▽?duì)1的結(jié)構(gòu)進(jìn)行衍生化[5～7]，可改善1的溶解性，達(dá)到提高活性和生物利用度的目的。

本文將1含有親水性基團(tuán)的N-芐氧羰基-甘氨酸通過(guò)DCC/DMAP促進(jìn)偶合法合成了一個(gè)新型的水飛薊賓衍生物——(N-芐氧羰基-甘氨酸-3-水飛薊賓酯(2， Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)UV，1H NMR， IR和ESI-MS表征。采用化學(xué)和生物模型考察了1和2的清除自由基能力和抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力。

1 2

Scheme1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

UV-2450型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(EtOH為溶劑)；L-2000型高效液相色譜儀(HPLC)； Bruker AV-600型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；Nicolet FT-IR 5700型傅立葉變換紅外光譜儀(KBr壓片)；Waters ZQ 4000/2695型氣-質(zhì)聯(lián)用儀。

1(95%)，遼寧盤(pán)錦格林恩生物資源開(kāi)發(fā)有限公司；N-芐氧羰基-甘氨酸，N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)， 4-二甲氨基吡啶(DMAP)，上海吉爾生化有限公司；1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)，長(zhǎng)城生物化學(xué)工程有限公司；水溶性維生素E(Trolox)， Sigma公司；大鼠肝微粒體，廈門(mén)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)院；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或色譜純，其中乙腈和丙酮使用前需作無(wú)水處理。

1.2 2的合成

在反應(yīng)瓶中加入1 2.41 g(5 mmol)的無(wú)水丙酮(30 mL)溶液，攪拌下于0 ℃～4 ℃依次加入N-芐氧羰基-甘氨酸1.25 g(6 mmol)的無(wú)水丙酮(15 mL)溶液， DMAP 73 mg(0.6 mmol);待溶液澄清后，于30 min內(nèi)緩慢滴加DCC 1.03 g(5 mmol)的無(wú)水丙酮(10 mL)溶液，滴畢，反應(yīng)1 h。升至室溫，再滴加DCC 206 mg(1 mmol)的無(wú)水丙酮(2 mL)溶液，滴畢，反應(yīng)4 h(TLC跟蹤)。三次過(guò)濾,濾液減壓濃縮，殘余物經(jīng)硅膠短柱快速柱層析[洗脫劑：V(氯仿) ∶V(丙酮) ∶V(冰醋酸)=20.0 ∶1.0 ∶0.1]純化得白色黏稠物，經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(冰醋酸)=30.0 ∶1.0 ∶0.1]純化得白色粉末2，收率37.5%； UVλ: 205.2， 288.3 nm；1H NMRδ： 11.41(s, 1H, 5-OH)， 11.06(s, 1H, 7-OH)， 9.18(s, 1H, 20-OH)， 8.31(s, 1H, NH)， 6.80～7.80(m, 11H, ArH)， 6.01(m, 1H, 3-H)， 5.98(d,J=1.8 Hz, 1H， 6-H)， 5.94(m, 1H, 8-H)， 5.52(d,J=12 Hz, 1H， 2-H)， 5.03(s, 2H, NCH2)， 4.99(t, 1H, 11-H)， 4.92(t, 1H, 23-OH)， 4.20(m, 1H, 10-H)， 3.78(s, 3H, 19-OCH3)， 3.55(m, 1H, 23-Ha)， 3.42(s, 2H, ArCH2)，3.34(m, 1H, 23-Hb)； IRν: 3 419(OH)， 2 921(CH3)， 1 756， 1 710(C=O)， 1 638(C=O)， 1 513(ArH)， 1 458(ArH)， 1 374(CH3)， 1 276(O-Ar)， 1 171， 1 082， 1 030， 825， 740， 677 cm-1； MSm/z： 672{[M-H]-}， 674{[M+H]+}， 696{[M+Na]+}， 712{[M+K]+}。

1.3 活性研究

(1) 清除DPPH自由基測(cè)試[8]

將藥樣乙醇溶液(c=0.8, 1.6, 2.4, 3.2, 4.0 mmol·L-1)0.5 mL置10 mL比色皿中，分別加入0.5 mL 0.6 mmol·L-1的DPPH乙醇溶液，用乙醇定容至5 mL。取0.5 mL的DPPH緩沖液用乙醇定容至5 mL做對(duì)照試驗(yàn)(以乙醇溶液做空白)。室溫下避光放置30 min，測(cè)定藥樣在517 nm處的吸光度A(每組樣品進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值)。按下式計(jì)算DPPH清除率(DPPH RSA)：

(2) 肝微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化模型測(cè)試[9]

以無(wú)水乙醇為溶劑，分別將1， 2和陽(yáng)性對(duì)照品Torlox配成濃度分別為10, 20, 30, 40 μmol·L-1的溶液。在10 mL比色管內(nèi)依次加入1.0 mL線粒體懸液，0.5 mL藥樣溶液，0.25 mL Trolox和0.25 mL Fe2+溶液，置37 ℃水浴中振蕩孵育1 h；加入20% TCA終止反應(yīng)。添加2 mL 0.67% TBA，于95℃(浴溫)顯色30 min；離心(3 500 r·min-1)10 min；取上清液于532 nm測(cè)定吸光值，每組實(shí)驗(yàn)做三次平行取其平均值。陽(yáng)性對(duì)照組添加溶液為1.0 mL線粒體懸液，0.5 mL蒸餾水，0.25 mL Trolox和0.25 mL Fe2+溶液；參比組添加溶液為1.0 mL線粒體懸液和1.0 mL蒸餾水。按下式計(jì)算抗氧化率：

2 結(jié)果與討論

不同的溶劑會(huì)影響反應(yīng)速率和產(chǎn)率，甚至改變反應(yīng)進(jìn)程。實(shí)驗(yàn)考察了乙腈、丙酮和DMF對(duì)反應(yīng)的影響，結(jié)果表明,常溫下1在乙腈中溶解性較差，在DMF中溶解性最好，但在TLC跟蹤監(jiān)測(cè)時(shí)拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，DMF在產(chǎn)物中的殘留亦難除去；反應(yīng)在丙酮中可以順利進(jìn)行。綜合考慮確定丙酮為反應(yīng)溶劑。由于1的羥基較多，部分副產(chǎn)物物化性質(zhì)相近，后續(xù)多次純化造成2的收率偏低。

c/mmol·L-1圖1 1和2的清除DPPH活性Figure 1 DPPH scavenging activities of 1 and 2

c/μmol·L-1圖2 1和2的抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性Figure 2 Inhibition of lipid peroxidantion of 1 and 2

1和2的清除DPPH自由基活性和抗脂質(zhì)過(guò)氧能力分別見(jiàn)圖1和圖2。從由圖1和圖2可見(jiàn)，在測(cè)定濃度范圍內(nèi)，2比1具有更好的清除DPPH活性和抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力。表現(xiàn)出濃度依賴性，隨著濃度逐漸增大，其活性體現(xiàn)為先提高后趨于穩(wěn)定。

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