玻璃化法冷凍和慢速冷凍對人類卵巢組織的影響

牛曉明

卵巢組織的冷凍保存是女性生殖保險的一種新方法。本研究分別采用玻璃化冷凍法及慢速程序冷凍法，將人類卵巢組織冷凍保存，解凍后對組織切片進行光鏡及卵泡凋亡觀察，比較不同冷凍保護方案對人類卵巢組織的保護作用，探究玻璃化法冷凍保存人類卵巢組織的可行性。

1 材料和方法

1.1 卵巢組織來源及處理 卵巢組織來自2009年7月至2010年7月期間，泰安市中心醫(yī)院生殖遺傳科因各種原因需部分卵巢組織的育齡期女性，共計19例。獲取的卵巢組織用含5%人血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液反復(fù)清洗后，去除卵巢髓質(zhì)、脂肪等雜質(zhì)部分，僅留卵巢皮質(zhì)并切割成約切成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，隨機分為3組:玻璃化冷凍組、程序冷凍組、新鮮對照組。

1.2 主要試劑 丙二醇(PRHO)、乙二醇(EG)、二甲基亞砜(DMSO)、蔗糖(S)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自美國Sigma公司，人血清白蛋白(HSA)購自瑞典Vitrolife公司

1.3 冷凍復(fù)蘇方案

1.3.1 玻璃化冷凍 冷凍方法:卵巢組織塊在冷凍基礎(chǔ)液(PBS+10%HSA)的培養(yǎng)皿中平衡10 min后，進行三步滲透平衡:①卵巢組織塊在冷凍液1(0.35 mol/L DMSO+0.38 mol/L PROH+0.38 mol/L EG+冷凍基礎(chǔ)液)的培養(yǎng)皿中平衡10 min。②4℃條件下卵巢組織塊在含冷凍液2(0.7 mol/L DMSO+0.75 mol/L PROH+0.75 mol/L EG+冷凍基礎(chǔ)液)的培養(yǎng)皿中平衡10 min。③4℃條件下卵巢組織塊在含冷凍液3(1.4 mol/L DMSO+1.5 mol/L PROH+1.5 mol/L EG+10%PVP的冷凍基礎(chǔ)液)的培養(yǎng)皿中平衡10 min。卵巢組織從冷凍液3中取出后，轉(zhuǎn)入開放式0.5 ml麥管中，然后將含有玻璃化冷凍組織的麥管置入預(yù)冷的5 ml冷凍管中后投入液氮中保存。復(fù)溫方法:①麥管從冷凍管中取出后直接置入37℃預(yù)熱的(PBS+10 mg/ml HSA+0.5 mol/L S)中置換5 min。②取出的卵巢組織在含有解凍液(PBS+10 mg/ml HSA+0.25 mol/L S)的培養(yǎng)皿中置換5 min。③取出的卵巢組織在含有解凍液(PBS+10 mg/ml HSA+0.125 mol/L S)的培養(yǎng)皿中置換5 min。④取出的卵巢組織在含有解凍液(PBS+10 mg/ml HSA)的培養(yǎng)皿中置換5 min。

1.3.2 慢速程序冷凍 冷凍方法參考Newton等［1 2］的慢速程序冷凍法:將卵巢組織投入含1.5 mol/L PROH+0.1 mol/L S+10 mg/ml HSA的PBS液中，室溫平衡90 min，裝入0.5 ml冷凍管中放于程序冷凍儀上，從室溫開始以2℃/min降至-7℃，人工植冰，再以0.3℃/min的降溫速率降至-30℃，以10℃/min的降溫速率降至-120℃，投入液氮中冷凍保存。復(fù)溫方法:將冷凍管自液氮罐中取出，置入37℃水浴箱中2-3 min，室溫中按含1.0 mol/L PROH、0.5 mol/L PROH的 PBS液梯度遞減洗脫冷凍保護劑各三遍，將組織移入含5%HSA的PBS液中完成復(fù)溫。

1.4 凍融后卵巢組織結(jié)構(gòu)分析

1.4.1 新鮮及凍融卵巢組織的組織學觀察 光鏡下觀察各級卵泡及卵巢間質(zhì)細胞的結(jié)構(gòu)形態(tài)學改變，計數(shù)形態(tài)正常和異常的間質(zhì)細胞、始基卵泡和初級卵泡。為避免重復(fù)計數(shù)，每間隔10個組織切片分析一次。

1.4.2 人類卵巢組織內(nèi)卵泡凋亡情況觀察 采用TUNEL實驗來觀察卵泡的凋亡情況。實驗步驟按照產(chǎn)品說明書進行。切片在光鏡隨機選取10個視野，計數(shù)全部及凋亡卵泡數(shù)，計算凋亡卵泡率。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。樣本率的比較采用Fisher's確切概率法或χ2檢驗。以α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 凍融后卵巢組織的形態(tài)學觀察 卵巢組織中形態(tài)正常的卵泡表現(xiàn)為卵泡及卵母細胞呈圓形，卵母細胞膜完整，細胞核形態(tài)正常。形態(tài)異常的卵泡表現(xiàn)為卵泡和卵母細胞形態(tài)失常，皺縮，卵母細胞漿內(nèi)出現(xiàn)較多空泡，細胞核固縮，卵母細胞外周顆粒細胞不完整。形態(tài)異常的間質(zhì)細胞主要表現(xiàn)為細胞核固縮。慢速程序冷凍組的異常卵巢間質(zhì)細胞比率高于玻璃化冷凍組和新鮮對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，玻璃化冷凍組與新鮮對照組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。各冷凍組的異常始基卵泡及初級卵泡比率均高于新鮮對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，各冷凍組間差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。見表1、2。

表1 不同冷凍方案卵巢間質(zhì)細胞形態(tài)學的改變

表2 不同冷凍方案卵泡形態(tài)學的改變

2.2 凍融卵巢組織中卵泡凋亡比值 3組中共計數(shù)了169個卵泡，凋亡卵泡比值分別為23.3%(10/43)、21.9%(9/41)、18.9%(11/37)組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表3。

表3 不同冷凍方案卵泡卵泡凋亡率比較

3 討論

放射療法及化學藥物療法的生殖細胞毒性作用，可導(dǎo)致女性惡性腫瘤患者卵巢功能衰竭［3］。為生殖保險而進行的人類卵巢組織冷凍保存已成為生殖醫(yī)學研究的熱點。傳統(tǒng)慢速程序冷凍法過程繁瑣，需要昂貴的程序冷凍儀，且對卵巢組織的間質(zhì)細胞保護效果欠佳［4］。有別于慢速程序冷凍法在降溫的冷凍過程中會形成冰晶，進而造成對組織的傷害，玻璃化冷凍技術(shù)的特點是使細胞本身及冷凍溶液在冷凍時，呈現(xiàn)黏稠而不產(chǎn)生結(jié)晶的玻璃化狀態(tài)，以改善慢速冷凍之缺點［5］。Miyamoto H 等［6］通過玻璃化冷凍大鼠卵巢后，觀察到卵巢形態(tài)學結(jié)構(gòu)保存良好。Isachenko等［7］采用乙二醇+蔗糖+蛋黃混合液作為玻璃化液，采用液氮直投法冷凍保存人類卵巢組織。研究發(fā)現(xiàn)，卵巢組織中的始基卵泡和初級卵泡可以得到很好地保存。本研究聯(lián)合應(yīng)用DMSO、EG、PROH，采用了三步滲透法，逐漸增加玻璃化冷凍保護劑濃度。為減小DMSO毒性，本研究在4℃下進行第二、三步平衡。并在第三步平衡時添加了PVP，PVP可以優(yōu)先同溶液中水分子結(jié)合，降低溶液中自由水的含量，使冰點降低，減少冰晶的形成。同時，由于其分子量大，使溶液中電解質(zhì)濃度降低，從而減輕溶質(zhì)損傷［8］。在冷凍過程中，我們使用了經(jīng)過開放式的冷凍麥管，盡可能減少組織周圍的液體容積，最大限度提高組織冷凍速度。復(fù)溫溶解時，解凍液中的蔗糖，提供了一個細胞外高滲環(huán)境，防止細胞腫脹造成的滲透休克［9］。

Demirci等［10］認為卵巢組織冷凍保存后，卵泡DNA損傷增加。本研究應(yīng)用TUNEL實驗來觀察DNA受損情況，發(fā)現(xiàn)冷凍組和對照組的卵泡凋亡率無統(tǒng)計學差異，證實玻璃化冷凍并不會造成卵泡DNA的損傷。

本研究證實采用DMSO、EG、PROH、PVP等作為冷凍保護劑，三步滲透平衡的玻璃化法，其冷凍保存人類卵巢組織中的始基卵泡和初級卵泡的功效與傳統(tǒng)慢速程序法相似，對卵巢間質(zhì)的保護優(yōu)于慢速程序冷凍法。不會造成卵泡DNA的損傷，且具有冷凍步驟簡單，無須昂貴、復(fù)雜的冷凍設(shè)備等優(yōu)點，是適宜的人類卵巢組織冷凍保存的方法。

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