潛陽通絡(luò)方對肝陽上亢證自發(fā)性高血壓大鼠左室肥厚及心肌內(nèi)皮素受體蛋白表達(dá)的影響

賈 蕊 王洪博 徐偉超 徐樹楠 (河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 0500)

潛陽通絡(luò)方對肝陽上亢證自發(fā)性高血壓大鼠左室肥厚及心肌內(nèi)皮素受體蛋白表達(dá)的影響

賈 蕊 王洪博1徐偉超 徐樹楠2(河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050011)

目的 觀察潛陽通絡(luò)方對肝陽上亢證自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)左室肥厚(LVH)及心肌ET受體(ETa、ETb)蛋白表達(dá)的影響。方法

用32只14周齡SHR大鼠，隨機(jī)分為模型組(M)、潛陽通絡(luò)方低劑量組(L)、潛陽通絡(luò)方高劑量組(H)和卡托普利對照組(C)。另購8只14周齡雄性Wistar大鼠，為空白對照組(K)。參照相關(guān)文獻(xiàn)，將SHR大鼠加灌附子湯法造肝陽上亢模型，實(shí)驗(yàn)期間每周末測量血壓，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取材，測量左室重量指數(shù)(LVMI)及ET受體蛋白表達(dá)。結(jié)果 ①對血壓的影響：治療結(jié)束后，與M組相比，其余各治療組血壓均有顯著下降(P＜0.01)，其中C、L、M三組之間兩兩比較，也均有顯著差異(P＜0.01);②對LVMI影響：與M組比較，D及G組LVMI均顯著降低(P＜0.05)，C組與M組比較，無顯著變化(P＞0.05);③對ET受體(ETa、ETb)蛋白表達(dá)的影響：M組大鼠ETa表達(dá)較K組明顯升高(P＜0.05)。治療后，與M組比較，C組、L組、H組明顯降低(P＜0.05)，且L、H兩組效果優(yōu)于C組(P＜0.05);M組大鼠ETb表達(dá)較N組明顯升高(P＜0.05)。治療后，與M組比較，C組、L組、H組明顯降低(P＜0.05)，且H組效果優(yōu)于C、L兩組(P＜0.05)。結(jié)論 潛陽通絡(luò)方的降壓和逆轉(zhuǎn)左室肥厚機(jī)制初步認(rèn)為與其降低體內(nèi)ET受體(ETa、ETb)表達(dá)有關(guān)。

血壓;左室重量指數(shù);ET受體表達(dá)

中醫(yī)對高血壓病左室肥厚的認(rèn)識，以往多單純責(zé)于肝陽、肝風(fēng)、氣滯(虛)血瘀、痰濁等為其病機(jī)基礎(chǔ)，論治上則對應(yīng)地用潛陽、息風(fēng)、行(補(bǔ))氣活血、化痰為常規(guī)法則，但臨床療效尚難盡如人意。究其原因在于本病的病因雖不一，但患者多為中老年人，均有臟腑陰陽氣血趨衰的共同表現(xiàn)，發(fā)展到一定程度，其基本發(fā)病機(jī)理大都是由陰陽失調(diào)，肝腎虧虛，肝陽偏旺，陽亢血澀，心脈瘀阻，心體負(fù)重所為。因此，我們對該病的病機(jī)提出“陽亢絡(luò)阻，心脈壅滯”學(xué)說，并擬定了潛陽通絡(luò)方治療高血壓左室肥厚，驗(yàn)之臨床取得了較好的療效。為了進(jìn)一步闡明本方的治療作用機(jī)制，采用病證合一的實(shí)驗(yàn)方法，以自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)左室肥厚加灌附子湯法復(fù)制肝陽上亢證模型后，再用潛陽通絡(luò)方進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，觀察該方對血壓、左室重量指數(shù)(LVMI)及內(nèi)皮素(ET)受體(ETa、ETb)蛋白表達(dá)的影響，目的為應(yīng)用本方治療高血壓左室肥厚提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

潛陽通絡(luò)方由龜板20 g(先煎)，牡蠣30 g(先煎)，懷牛膝 30 g，白芍20 g，天麻12 g，石決明30 g(先煎)，鉤藤 12 g(后下)，赤芍15 g，丹參20 g，全蝎6 g，地龍12 g，當(dāng)歸12 g，甘松9 g等藥組成(購自石家莊市樂仁堂大藥房)。卡托普利(規(guī)格25 mg，常州制藥廠生產(chǎn)，批號09120212)。免疫組化及DAB試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.2 動物

14周齡SHR32只，雄性，體重280～320 g，血壓160～190 mmHg，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司(合格證號0166397)。14周齡 Wistar大鼠8只，雄性，體重280～320 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(合格證號1003163)。

1.3 儀器與設(shè)備

BESN-Ⅱ 型多通道動物無創(chuàng)測壓系統(tǒng)，南京德賽生物技術(shù)有限公司生產(chǎn);HMIAS-2000顯微圖像分析系統(tǒng)，購自武漢同濟(jì)醫(yī)科大學(xué);自制旋轉(zhuǎn)平臺。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 給藥方法 32只SHR隨機(jī)分為模型組(M)、潛陽通絡(luò)方低劑量組(L)、潛陽通絡(luò)方高劑量組(H)、和卡托普利對照組(C)。8只Wistar大鼠空白對照組(K)。以上各組均適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，開始進(jìn)入實(shí)驗(yàn)觀察。大鼠模型參照相關(guān)文獻(xiàn)〔1〕，選用SHR加灌附子湯的方法造模，灌胃劑量為10 ml·kg-1·d-1，相當(dāng)生藥劑量2 g·kg-1·d-1，共4 w，同時觀察大鼠基本情況變化：當(dāng)出現(xiàn)毛色干枯、失去光澤、消瘦、飲水量增多、性情暴躁、旋轉(zhuǎn)時間縮短等異常表現(xiàn)則提示造模成功。隨即停止灌服附子湯，空白組和模型組改灌等量蒸餾水，卡托普利組灌服卡托普利混懸液，生藥劑量8 mg·kg-1·d-1，潛陽通絡(luò)方低劑量組灌服中藥濃縮液，生藥劑量24.6 g·kg-1·d-1，潛陽通絡(luò)方高劑量組生藥劑量49.2 g·kg-1·d-1，以上各組均由涼白開水和普通飼料飼養(yǎng)，共6 w。

1.4.2 指標(biāo)檢測 ①血壓測定：造模結(jié)束后，分別于每周末測量血壓，按照無創(chuàng)測壓儀說明書規(guī)范操作，每只大鼠測三次取平均值，作為其在該周的血壓值;②LVMI：大鼠斷頭處死后，迅速打開胸腔，取出心臟，蒸餾水沖洗，洗凈血液，濾紙吸干，沿房室間溝剪去心房，再沿室間隔剪去右心室，剩下左心室，稱重后計(jì)算心肌重量與體重之比，即為左室重量指數(shù);③大鼠ET受體蛋白表達(dá)的檢測：采用免疫組化染色法。取左心室小塊心肌，石蠟包埋切片，常規(guī)脫蠟至水。熱修復(fù)抗原，3%H2O2去離子水孵育5～10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。滴加正常山羊血清工作液封閉特異性抗原。滴加一抗，37℃孵育2～3 min，4℃過夜。PBS沖洗3次。滴加生物素化二抗工作液，37℃孵育10～15 min。再滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育10～15 min。DAB顯色，復(fù)染、脫水、透明，中性樹膠封片，HMIAS-2000顯微圖像分析系統(tǒng)拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 潛陽通絡(luò)方對SHR血壓的影響

表1顯示，與K組相比，M組血壓明顯上升(P＜0.01);治療結(jié)束后，與M組相比，其余各治療組血壓均有顯著下降(P＜0.01)，其中C、L、M三組之間兩兩比較，也均有顯著性差異(P＜0.01)，但C與K比較差別不顯著(P＜0.05)。

表1 潛陽通絡(luò)方對SHR血壓的影響(±s，n=8，mmHg)

表1 潛陽通絡(luò)方對SHR血壓的影響(±s，n=8，mmHg)

與K組比較：1)P＜0.01;與M比較：2)P＜0.01;與C組比較：3)P＜0.01;與L組比較：4)P＜0.01

組別 治療后1 w 治療后2 w 治療后3 w 治療后4 w 治療后5 w 治療后6 w K組 108.50±0.87 109.63±1.51 108.00±1.31 107.88±0.83 109.13±0.54 109.13±0.79 M組 201.63±0.921) 201.38±0.781) 201.38±0.631) 208.00±0.931) 209.25±0.591) 208.75±0.561)C組 144.13±0.932) 111.75±1.732) 109.50±1.21 11.00±0.962) 111.00±0.962) 112.25±0.922)L組 191.13±1.102)3) 178.00±1.162)3) 167.50±1.242)3) 160.00±0.802)3) 152.88±1.012)3) 153.63±1.032)3)H組 190.75±0.982)3) 180.50±1.022)3) 169.25±1.362)3) 160.75±0.992)3) 150.88±0.772)3) 147.75±1.062)3)4)

2.2 潛陽通絡(luò)方對SHR LVMI的影響

與K組相比，M組LVMI明顯升高〔(2.63±0.04)mg/kg vs(1.91±0.07)mg/kg，P＜0.01〕;與 M組相比，L、H劑量中藥治療組 LVMI明顯下降〔(2.48±0.04)mg/kg，P＜0.05〕;C組與 M 組相比差別不明顯〔(2.57±0.02)mg/kg，P ＞0.05〕，H 組與 C 組相比差別明顯(P＜0.05)。

2.3 潛陽通絡(luò)方對SHR ET受體蛋白表達(dá)的影響

表2顯示：M組大鼠ETa受體表達(dá)較K組明顯升高(P＜0.05)。治療后，與M組比較，C組、L組、H組明顯降低(P＜0.05)，且L、H兩組效果優(yōu)于C組(P＜0.05)。M組大鼠ETb受體表達(dá)較K組明顯升高(P＜0.05)。治療后，與M組比較，C組、L組、H組明顯降低(P＜0.05)，且H組效果優(yōu)于C、L兩組(P＜0.05)。圖1、圖2顯示黃色區(qū)域較多則表達(dá)較明顯，N組大鼠ET受體表達(dá)正常，黃色區(qū)域不明顯。M組大鼠ETRa、ETRb受體表達(dá)明顯增強(qiáng)，黃色區(qū)域分布廣、密度高。經(jīng)治療后L組、H組表達(dá)均不同程度下降，黃色區(qū)域分布密度較稀疏，X組變化不明顯。

表2 潛陽通絡(luò)方對SHR ET受體蛋白表達(dá)的影響( s，n=8)

表2 潛陽通絡(luò)方對SHR ET受體蛋白表達(dá)的影響( s，n=8)

與K組比較：1)P＜0.05，與M組比較：P＜0.05，與C組比較：3)P＜0.05，與 H組比較：4)P ＜0.05

組別ETa ETb K組0.183±0.004 0.182±0.002 M組 0.295±0.0041) 0.291±0.0031)C組 0.276±0.0041)2) 0.266±0.0021)2)3)L組 0.248±0.0041)2)4) 0.262±0.0021)2)4)H組 0.243±0.0041)2)3) 0.244±0.0031)2)

圖1 潛陽通絡(luò)方對SHR ETa受體蛋白表達(dá)的影響(×200)

圖2 潛陽通絡(luò)方對SHR ETb受體蛋白表達(dá)的影響(×200)

3 討論

我們認(rèn)為，高血壓左室肥厚的病位在心絡(luò)，涉及肝腎，主要病機(jī)為“陽亢絡(luò)阻，心脈壅滯”，是在肝腎陰虛的基礎(chǔ)上衍生的。產(chǎn)生的原因有二：一是肝熱致絡(luò)阻。高血壓患者素來性情急躁，日久肝郁化熱，血受熱煎熬凝聚，而成熱瘀互結(jié)，血脈郁滯而導(dǎo)致瘀血阻絡(luò)。此即是《醫(yī)林改錯》所說的“血受熱則煎熬成塊”之理。二是陰虧致絡(luò)阻。高血壓陽亢證是在陰虧的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的，陰虛則津虧液少，勢必不能載血循經(jīng)暢行，加之陽亢燥熱內(nèi)灼，煎熬營血，血行澀滯，可導(dǎo)致瘀血阻絡(luò)，故《讀醫(yī)隨筆》說：“陰虛必血滯?！庇纱丝梢姡徽撌歉螣嶂陆j(luò)阻，還是陰虧致絡(luò)阻，皆導(dǎo)致血行澀滯，心亦受累，勢必加重心主血脈的負(fù)荷而病為心脈痹阻，日久則心體增生變厚，臨床即出現(xiàn)所謂左室肥厚的病理改變。鑒于此，潛陽通絡(luò)方中重用懷牛膝活血化瘀、引血下行，以減輕頭部充血，且能補(bǔ)肝腎以治其本，有移盈補(bǔ)虧之效;龜板、白芍、天麻益陰潛陽;石決明、牡蠣、鉤藤清肝、平肝潛陽，以降肝火夾血上沖;全蝎、地龍通經(jīng)活絡(luò);赤芍、丹參活血化瘀，以增強(qiáng)通經(jīng)藥通行絡(luò)脈之力;當(dāng)歸補(bǔ)血活血，通過補(bǔ)虛行瘀之途徑來改善血流供求平衡;甘松行氣，以增強(qiáng)活血通絡(luò)之力。諸藥合用，共成滋陰潛陽，通絡(luò)活血之劑。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為：鉤藤、地龍、全蝎能直接和間接抑制血管運(yùn)動中樞及阻滯交感神經(jīng)和神經(jīng)節(jié)，擴(kuò)張血管，使外周血管阻力降低;懷牛膝、赤芍、石決明能擴(kuò)張血管，降低外周血管阻力;白芍不僅抑制血管緊張素Ⅱ形成而產(chǎn)生降壓作用，而且又能夠逆轉(zhuǎn)左室肥厚;當(dāng)歸、丹參、赤芍除擴(kuò)張血管作用外，又有鈣離子拮抗作用，在降低血壓、逆轉(zhuǎn)左心室肥厚的同時，可使細(xì)胞膜鈉泵活性及線粒體鈣泵運(yùn)動恢復(fù);龜板有補(bǔ)血，鎮(zhèn)靜及抗凝血，增加冠脈血流量等作用;牡蠣有鎮(zhèn)靜，抗凝血，抗血栓作用;天麻能對抗腎上腺素的縮血管效應(yīng)，舒張周圍血管，降低血管阻力，從而達(dá)到降壓之效，且天麻有止痛作用，可對高血壓引起的頭痛有很好的治療效果;甘松有降血壓，抗心肌缺血，抗心律失常等作用。基于這些藥理作用，所以用滋陰潛陽、通絡(luò)活血藥組成復(fù)方，共同達(dá)到擴(kuò)張血管，降低血壓，改善血液循環(huán)，減輕或逆轉(zhuǎn)左室肥厚的目的。

ETa亞型受體分布血管平滑肌上，激動時引起血管收縮;ETb亞型受體分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞上，激動時通過釋放EDRF(內(nèi)皮依賴性舒張因子)引起血管舒張〔2〕。而ET與血管平滑肌細(xì)胞上的ETa受體結(jié)合，既可直接刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖肥大，使血管變窄、管壁增厚，增加外周阻力使心臟后負(fù)荷增加;同時又能刺激其他血管物質(zhì)，如去甲腎上腺素(NE)和血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的釋放，引起縮血管作用，產(chǎn)生高血壓(EH)和促心肌平滑肌細(xì)胞增殖，如此形成惡性循環(huán)〔3〕。若ET與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的ETb受體結(jié)合，則刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放舒血管因子，可起到擴(kuò)張血管，增加一氧化氮和前列環(huán)素濃度，增加肺清除ETa等作用〔4〕。緣于此，ETa和ETb則構(gòu)成了一對具有拮抗效應(yīng)的血管活性物質(zhì)。由于血管內(nèi)皮細(xì)胞既可合成和釋放ET，也可釋放內(nèi)皮依賴性舒張因素(EDRF)和前列環(huán)素(PGI2)，后兩者均可拮抗ETa的縮血管效應(yīng)，擴(kuò)張血管平滑肌，此為調(diào)節(jié)血管基礎(chǔ)張力，維持血壓穩(wěn)定的主要因素。因此，血管對ETa的縮血管反應(yīng)取決于血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的舒血管因子與縮血管因子之間的動態(tài)平衡，舒張因子占優(yōu)勢，可以抑制血管過度收縮及血小板的激活，從而對循環(huán)系統(tǒng)起到了保護(hù)作用〔5〕。但衰老或疾病時(如高血壓、高脂血癥及動脈粥樣硬化)，這些保護(hù)機(jī)制失去平衡，則收縮因子占優(yōu)勢，從而內(nèi)皮依賴性舒張減弱，而ETb不能拮抗ETa，就導(dǎo)致血管收縮，外周血管阻力增加，產(chǎn)生高血壓及心肌平滑肌細(xì)胞增殖。可見，ETa和ETb比例失衡在高血壓左心室肥厚發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示潛陽通絡(luò)方能夠降低內(nèi)皮素受體在心臟局部的表達(dá)，是通過調(diào)節(jié)ETa和ETb受體的表達(dá)比例，使二者失衡狀態(tài)得以糾正，血管舒縮功能得到改善，進(jìn)而降低血管的阻力、阻止心臟及血管增生，從而達(dá)到降低血壓和逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞增生肥大的作用。但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

1 鄢東紅，金益強(qiáng)，肖 純.自發(fā)性高血壓大鼠肝陽上亢證模型的復(fù)制〔J〕. 湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1999;19(4)：35-8.

2 衛(wèi)生部繼續(xù)教育委員會.心血管病學(xué)分冊〔M〕.長春：長春出版社，1999：305.

3 葉 平，李小鷹.高血壓的診斷與治療〔M〕.北京：人民軍醫(yī)出版社，2000：74.

4 孔令雷，顏玲娣，宮澤輝.內(nèi)皮素系統(tǒng)與心肌肥厚〔J〕.中國藥理學(xué)通報(bào)，2008;24(9)：1127-30.

5 Furchgott RF，Yanhoutte PM.Endothelium dependent relaxing and contracting factors〔J〕.FASEB J，1989;3(9)：2007-18.

R541.4

A

1005-9202(2012)23-5212-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.050

河北省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目(No.2007017)

1 河北省胸科醫(yī)院 2 河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院

徐樹楠(1952-)，男，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥基礎(chǔ)理論及其對心血管病應(yīng)用的研究。

賈 蕊(1986-)，女，碩士，主要從事中醫(yī)藥對腎病及心血管病的防治研究。

〔2011-11-07收稿 2012-03-10修回〕

(編輯 曹夢園)