蛋白酶體抑制劑Bortezomib對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的體外作用

丁秀杰 王 雪 冷維春 王立巖 田秀娟 (九臺(tái)市營城煤機(jī)廠職工醫(yī)院，吉林 九臺(tái) 30502)

蛋白酶體抑制劑Bortezomib對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的體外作用

丁秀杰 王 雪1冷維春1王立巖1田秀娟1(九臺(tái)市營城煤機(jī)廠職工醫(yī)院，吉林 九臺(tái) 130502)

目的 探討蛋白酶體抑制劑Bortezomib對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞存活率的影響。方法 MTT檢測(cè)Bortezomib對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞體外生長及增殖的影響;并用Western印跡、RT-PCR檢測(cè)NF-κB(P65)蛋白和mRNA表達(dá)水平的變化。結(jié)果 (1)MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，Bortezomib 1.25 μmol/L 組〔(84.9 ±0.08)%〕、Bortezomib 2.50 μmol/L 組〔(67.1 ±0.12)%〕、Bortezomib 5.00 μmol/L 組〔(51.6 ±0.11)%〕、Bortezomib 10.00 μmol/L組〔(41.3±0.13)%〕及Bortezomib 20.00 μmol/L組〔(20.8±0.12)%〕Hela細(xì)胞增殖率明顯降低(P＜0.05)。(2)Western印跡檢測(cè)結(jié)果表明：隨著Bortezomib濃度的增高，NF-κB(P65)蛋白表達(dá)量有劑量依賴性的降低趨勢(shì)(P＜0.05)。(3)RT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，隨著Bortezomib濃度的增加，NF-κB(P65)mRNA的表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)。結(jié)論 蛋白酶體抑制劑Bortezomib能夠體外抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的短期增殖，其機(jī)制與下調(diào)NF-κB(P65)的表達(dá)密切相關(guān)。

蛋白酶體抑制劑;Bortezomib;宮頸癌;Hela細(xì)胞

蛋白酶體抑制劑是一類能通過與蛋白酶體內(nèi)的酶解活性位點(diǎn)結(jié)合，而阻礙靶蛋白降解的藥物。大多數(shù)調(diào)節(jié)蛋白都存在于蛋白酶體內(nèi)，它們參與細(xì)胞生長、增殖、分化及凋亡。近年來很多研究表明，蛋白酶體抑制劑對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用〔1〕，因此它已經(jīng)成為治療惡性腫瘤的新靶點(diǎn)。蛋白酶體抑制劑包括 Bortezomib、MG132、TMC-95A和 Bortezomib等。本實(shí)驗(yàn)選用代謝穩(wěn)定、作用時(shí)間較長的Bortezomib，探討其體外對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖率的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

宮頸癌Hela細(xì)胞株和蛋白酶體抑制劑Bortezomib均由吉林大學(xué)病理生理教研室提供。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) Hela細(xì)胞株用IMDM培養(yǎng)基(含10%新生胎牛血清、青霉素與鏈霉素各100 U/ml)，37℃ 5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，以0.25%胰酶消化傳代，每1～2 d傳代1次，按1∶3傳代，試驗(yàn)選用生長狀態(tài)良好的處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.2.2 MTT檢測(cè)法 選取對(duì)數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，96孔板種細(xì)胞數(shù) 1×104個(gè)/孔，每孔加100 μl完全培養(yǎng)基，24 h后，每孔加入100 μl含不同濃度藥物的培養(yǎng)基。分為對(duì)照組和Bortezomib 1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 μmol/L 五組，每組 5 復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后每孔加入MTT 10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4～5 h，棄掉培養(yǎng)液，每孔加150 μl DMSO，振蕩10 min至結(jié)晶物完全融解。在BIO-TEK酶標(biāo)儀上，選擇570 nm或490 nm波長，測(cè)定各孔光吸收值，計(jì)算細(xì)胞抑制率%=(對(duì)照組A均值-實(shí)驗(yàn)組A均值)/對(duì)照組A均值×100%。細(xì)胞存活率%=實(shí)驗(yàn)組A均值/對(duì)照組A均值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 Western印跡 收集Hela細(xì)胞，胰酶消化后，800 r/min離心5 min，棄上清，1×PBS洗三次，將細(xì)胞移入EP管中，每瓶細(xì)胞約加入細(xì)胞裂解液100～200 μl，12 000 r/min離心5 min，收集蛋白，測(cè)定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳、轉(zhuǎn)膜、奶粉封閉，一抗，室溫放置30 min，4℃搖床上過夜，二抗(1∶1 000或1∶2 000)，搖床上室溫放置1～2 h后顯色，顯色結(jié)束后，膜拍照封存，分析核因子(NF)-κB(P65)蛋白的表達(dá)情況。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)NF-κB(P65)mRNA的表達(dá)

1.2.4.1 細(xì)胞總RNA提取 用Trizol(invitrogen)提取總RNA，用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度以及OD260/OD280。

1.2.4.2 逆轉(zhuǎn)錄 微量離心管內(nèi)取1 μg模板RNA溶液、4 μl 5×RT緩沖液、2 μl dNTP 混合液(每種10 mmol/L)、20 U Oligo(dT)18 Primer和 10 U AMV Reverse Transcriptase，用 0.1%DEPC水補(bǔ)足至20 μl，混勻后室溫放置10 min，再移入42℃恒溫水浴中1 h，然后冰水中冷卻2 min，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

1.2.4.3 PCR NF-κB 上游引物：5'-ACCACTGCTCAGGTCCACT-GTC-3'，下游引物：5'-GCTGTCACTATCCCGGAGTTCA-3';GAPDH上游引物：5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3'5'-GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT-3'，下 游 引 物 5'-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3'，5'-AAGAATGGGTGTTGCTGTTGAAGTC-3'。PCR 擴(kuò)增體系總體積為 25 μl，內(nèi)含 12.5 μl TaKaRa Taq酶、10.5 μl ddH2O、1 μl模板 cDNA 和1 μl引物。擴(kuò)增條件：變性(94℃、2 min);退火，復(fù)性(30 s)，延伸(72℃、30 s)、30 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，采用GIS凝膠成像系統(tǒng)照相，分析電泳條帶光密度值，NF-κB(P65)mRNA的含量以目的基因與內(nèi)參GAPDH比值確定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Bortezomib對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞體外增殖的抑制作用

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，Bortezomib 1.25 μmol/L組〔(84.9 ± 0.08)%〕)、2.50 μmol/L 組 〔(67.1 ± 0.12)%〕、5.00 μmol/L組〔(51.6 ±0.11)%〕、10.00 μmol/L 組〔(41.3 ±0.13)%〕及 20.00 μmol/L 組〔(20.8±0.12)%〕Hela細(xì)胞增殖率明顯降低(P＜0.05)。

2.2 Bortezomib體外作用后Hela細(xì)胞NF-κB(P65)蛋白的表達(dá)

分別用0、2.50、5.00、10.00 μmol/L Bortezomib 體外作用于Hela細(xì)胞發(fā)現(xiàn)Bortezomib濃度越高，NF-κB(P65)蛋白表達(dá)減弱的越明顯(P＜0.05)。見圖1。

2.3 Bortezomib體外對(duì)Hela細(xì)胞的NF-κB(P65)mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR電泳結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，隨著Bortezomib濃度的增加，NF-κB(P65)mRNA的表達(dá)明顯減弱(P＜0.05)。見圖2。

圖1 宮頸癌Hela細(xì)胞中NF-κB(P65)蛋白表達(dá)

圖2 宮頸癌Hela細(xì)胞中NF-κB(P65)mRNA表達(dá)

3 討論

近年來，宮頸癌的發(fā)病率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，宮頸癌的藥物治療仍然主要是靠傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物，缺少選擇性的抑制腫瘤作用;而蛋白酶體抑制劑則不同，它是一組ATP依賴性蛋白水解酶復(fù)合體，通過抑制蛋白酶體的活性來阻斷細(xì)胞蛋白的降解，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。研究表明，蛋白酶體與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和維持細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要的作用，它能水解催化多種蛋白，是細(xì)胞中除溶酶體以外最主要的蛋白質(zhì)降解場(chǎng)所。也就是說，蛋白酶體抑制劑是一類能阻礙靶蛋白降解的藥物，與蛋白酶體內(nèi)的酶解活性位點(diǎn)結(jié)合，阻斷細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解，進(jìn)而影響細(xì)胞原有的增殖、分化和凋亡〔2〕。近年來，很多研究表明蛋白酶體抑制劑具有明顯的抗腫瘤活性〔3〕，并且對(duì)多種惡性腫瘤具有明顯的抑制作用〔4〕。

Bortezomib是蛋白酶體抑制劑的一種，屬于合成的肽硼酸酯類抑制劑，可以抑制體內(nèi)蛋白酶體的糜蛋白酶樣活性和胰蛋白酶樣活性，Bortezomib的抑制作用屬于可逆性抑制，不僅與活性位點(diǎn)的結(jié)合速度慢，與之解離的速度也比較慢，因此，它在體內(nèi)不易被氧化，不易失效，代謝穩(wěn)定，作用時(shí)間較長。有研究證實(shí)，當(dāng)應(yīng)用計(jì)量為推薦劑量時(shí)，即1.3 mg/m2時(shí)，細(xì)胞內(nèi)60% ～70%的蛋白酶體的功能將受到抑制，一般恢復(fù)時(shí)間在72 h內(nèi)。Bortezomib對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用更強(qiáng)，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞對(duì)蛋白酶體抑制的敏感性為正常細(xì)胞的100～1 000倍〔5〕。

本次體外實(shí)驗(yàn)表明，Bortezomib對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞有明顯的體外增殖抑制作用。另外，NF-κB作為一種以非活性狀態(tài)廣泛存在于各種類型細(xì)胞胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)免疫應(yīng)答及細(xì)胞增殖等多種基因的表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，是控制早期基因表達(dá)的基因開關(guān)〔6〕。當(dāng)細(xì)胞受到多種因素刺激后，NF-κB被激活，隨之轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核內(nèi)，通過與κB位點(diǎn)結(jié)合而調(diào)節(jié)許多靶基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的生物學(xué)行為〔6〕。NF-κB 包括五種基因，即 NF-κB1(p50/p105)、NF-κB2(p52/p100)、RelA(p65)、RelB以及c-Rel，這五種基因可以翻譯成七種蛋白。蛋白酶體降解 IκB在NF-κB激活中有重要作用，由于在NF-κB的激活過程中存在瞬時(shí)性，同時(shí)具備可誘導(dǎo)性，因此在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，各種分子改變都可能阻礙NF-κB激活調(diào)節(jié)機(jī)制，從而使NF-κB激活調(diào)節(jié)機(jī)制失去可控性，同時(shí)也就促使NF-κB的持續(xù)激活，最終使 NF-κB的靶基因表達(dá)失控。因此，腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、凋亡、黏附、轉(zhuǎn)移、耐藥等過程都可能有NF-κB的參與〔7〕。研究表明，腫瘤細(xì)胞增殖是NF-κB通過上調(diào)細(xì)胞周期素 cyclin D1，D2，D3，cyclin E 實(shí)現(xiàn)的〔8〕。誘導(dǎo) NF-κB 表達(dá)可以增加血管內(nèi)皮生長因子和環(huán)氧合酶-2的激活，促進(jìn)腫瘤血管的生成〔9〕。NF-κB可以上調(diào)多藥耐藥蛋白 P-gly的表達(dá)，而 P-gly蛋白可以通過能量依賴的方式將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物排除到細(xì)胞外，使化療藥物無法傷害腫瘤細(xì)胞，腫瘤的耐藥過程可能有NF-κB的激活〔10〕。蛋白酶體抑制劑 Bortezomib有化療增敏作用，與其對(duì) NF-κB的抑制作用有關(guān)。因此，我們推測(cè)，腫瘤細(xì)胞的凋亡和化療的增敏作用，可能是通過阻礙 NF-κB激活而抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移來發(fā)揮作用的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，不同濃度Bortezomib處理組的Hela細(xì)胞中NF-κB(P65)蛋白的表達(dá)明顯下降，說明Bortezomib可能通過阻礙NF-κB蛋白激活來抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖。

1 孔曉霞.Bcl-2在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自吞噬和凋亡中的作用機(jī)制〔D〕.長春：吉林大學(xué)博士論文，2009.

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R73

A

1005-9202(2012)23-5210-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.049

1 吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院

田秀娟(1964-)，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事婦科腫瘤學(xué)研究。

丁秀杰(1965-)，女，主治醫(yī)師，主要從事婦產(chǎn)科臨床工作。

〔2012-02-10收稿 2012-05-21修回〕

(編輯 徐 杰)