lgr5啟動(dòng)子甲基化在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及臨床意義

費(fèi) 夢(mèng)

(荊州市第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 荊州 434000)

張傳宏

(荊州市第二人民醫(yī)院MRI室，湖北 荊州 434000)

lgr5啟動(dòng)子甲基化在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及臨床意義

費(fèi) 夢(mèng)

(荊州市第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 荊州 434000)

張傳宏

(荊州市第二人民醫(yī)院MRI室，湖北 荊州 434000)

目的：探討lgr5甲基化與人類卵巢癌臨床病理之間的聯(lián)系，以及其作為判定總的生存率的價(jià)值。 方法：采用甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(methylation specific polymerase chain reaction，MSP)方法分析卵巢癌患者石蠟組織中l(wèi)gr5啟動(dòng)子DNA甲基化情況。 結(jié)果：lgr5在正常卵巢組織中幾乎無甲基化改變，而在良性卵巢腫瘤中頻率升高，上皮性卵巢癌組織中甲基化頻率明顯升高(P<0.01)；lgr5甲基化與低分化上皮性卵巢癌 (P<0.01)、腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ(P<0.05)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.01)相關(guān)，但與組織類型關(guān)系不明顯(P>0.05)。在70例上皮性卵巢癌患者組織中，lgr5甲基化頻率為62.9%(44/70)，并且5年總的生存率明顯低于未甲基化的患者(P<0.05)。結(jié)論：lgr5甲基化與上皮性卵巢癌分化程度、腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，同時(shí)也可以作為上皮性卵巢癌患者總的生存率的判定指標(biāo)之一。

lgr5 甲基化；上皮性卵巢癌；總的生存率；甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(MSP)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的3種惡性腫瘤之一，因其早期臨床癥狀不明顯，起病隱匿，許多患者確診時(shí)已是晚期。卵巢癌分型中上皮性約占90%，手術(shù)和以鉑類為基礎(chǔ)的化療是上皮性卵巢癌的主要治療方式，但大部分患者癌細(xì)胞耐藥導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)，致使卵巢癌患者5年生存率不到30%[1-2]。因此，尋找卵巢癌致瘤基因以及治療靶點(diǎn)是阻止或根治卵巢癌的研究熱點(diǎn)。lgr5是近年來發(fā)現(xiàn)的一種致瘤基因，與卵巢癌、結(jié)腸癌、皮膚基底細(xì)胞癌以及肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展都有著密切聯(lián)系[3-5]，特別是lgr5可以作為結(jié)腸癌和皮膚癌的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志，并被認(rèn)為是腫瘤的致瘤起源[6-7]。最近日益重視的腫瘤致瘤機(jī)制中DNA甲基化是一個(gè)重要的表觀修飾方式，致瘤基因的高甲基化通常會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8]。我們?cè)噲D通過檢測(cè)lgr5甲基化狀態(tài)改變，分析其甲基化與臨床病理之間的聯(lián)系，繼而分析甲基化對(duì)卵巢癌預(yù)后判定的意義。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象

選取荊州市第二人民醫(yī)院2000年到2006年間手術(shù)切除的卵巢石蠟組織標(biāo)本?；颊吣挲g27～82歲，平均49.75歲。所有標(biāo)本經(jīng)病理切片確診，其中上皮性卵巢癌70例，交界性卵巢癌25例，良性卵巢腫18例瘤和正常卵巢組織30例。上皮性卵巢癌中，漿液性囊腺癌35例，粘液性囊腺癌19例，卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌11例，透明細(xì)胞癌5例；高分化15例，中分化22例，低分化33例；按照國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)2000年制定的臨床手術(shù)病理分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ～Ⅱ期25例，Ⅲ～Ⅳ45例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例，未轉(zhuǎn)移29例。所有病例手術(shù)前均未進(jìn)行放射治療及化學(xué)藥物治療。組織標(biāo)本經(jīng)過10%福爾馬林固定，石蠟包埋。70例上皮性卵巢癌納入隨訪病例，隨訪期限為60個(gè)月，無1例失訪。

1.2方法

1.2.1 石蠟標(biāo)本中DNA提取和亞硫酸鹽修飾 用75%酒精擦拭切片刀、切片臺(tái)等，紫外線照射消毒30min，取3～5片10μm的石蠟切片置入干凈的1.5EP管。加入二甲苯1ml，室溫靜置15min，50℃孵育35min，70℃孵育5min。待液體清澈后，12000rpm，離心5min后，去掉上清，然后按照DNA提取試劑盒說明書操作(Qiagen)。操作完畢后，測(cè)定DNA濃度，取500ngDNA 按照DNA亞硫酸鹽修飾試劑盒操作(Zymo reseach)。

1.2.2 MSP及電泳 應(yīng)用在線工具methyprimer分析lgr5啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)甲基化引物和未甲基化引物[9]，并提交上海英偉杰基公司合成。取2μl修飾后的DNA加入到12.5μl 熱啟動(dòng) premix (Takara)，MSP引物各1μl；USP引物各1μl，然后用DEPC水補(bǔ)充到25μl。MSP 引物序列為： CGGTAATCGGTATTTTTGTTTTC(上游)，TAAACTTCTACAACTCAACGAACGT(下游)；USP引物序列為： GGTGGTAATTGGTATTTTTGTTTTTT(上游)，AAACTTCTACAACTCAACAAACATC(下游)。模板以ddH2O為空白對(duì)照。反應(yīng)條件為：95℃5min；95℃45s，60℃1min(MSP)/ 59℃1min(USP)，72℃50s，40個(gè)循環(huán)；72℃7min。反應(yīng)結(jié)束后，取10μl產(chǎn)物在2%瓊脂糖膠電泳分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間差異采用多個(gè)樣本率的χ2檢驗(yàn)，總的生存率分析采用Kaplan-Meier分析，α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1lgr5甲基化在各種卵巢組織中表達(dá)的變化

在正常卵巢組織檢測(cè)到1例甲基化，良性卵巢腫瘤檢測(cè)到2例(占11.1%)，在交界性囊腺瘤組織中甲基化8例(占32.0%)，在上皮性卵巢癌中甲基化44例(占62.9%)。在上皮性卵巢癌組織和卵巢交界性囊腺瘤組織中，lgr5甲基化頻率相對(duì)于正常卵巢組織和卵巢囊腺瘤組織中明顯升高，兩組之間比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=39.372，P<0.01)。而上皮性卵巢癌組織與卵巢交界性囊腺瘤相比(χ2=7.079，P=0.008)，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異。結(jié)果說明，lgr5甲基化在卵巢組織癌變過程中逐步升高。

2.2lgr5與上皮性卵巢癌臨床病理之間的關(guān)系

表1 lgr5甲基化與上皮性卵巢癌臨床病理之間的關(guān)系

圖1 lgr5甲基化與未甲基化預(yù)測(cè)卵巢癌患者總的生存率

lgr5甲基化頻率在上皮性卵巢癌組織分型中改變無差異，漿液性囊腺癌中甲基化頻率為20/35，粘液性囊腺癌14/19，卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌7/11，透明細(xì)胞癌3/5，組間差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.485，P=0.476)。在上皮性卵巢癌中，低分化癌組織中l(wèi)gr5甲基化頻率明顯高于高、中分化(χ2=11.655，P=0.003)；在Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌中，lgr5甲基化明顯增高，與Ⅰ～Ⅱ期相比有顯著差異(χ2=5.923，P=0.020)；并且lgr5高甲基化預(yù)示著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=6.894，P=0.009)(見表1)。

2.3lgr5甲基化與卵巢癌總的生存預(yù)后的關(guān)系

在70例上皮性卵巢癌患者組織中，lgr5高甲基化患者約占62.9%(44/70)，與未甲基化的卵巢癌患者相比，5年生存率明顯降低(P=0.020)，lgr5甲基化患者的中位生存時(shí)間為44.8個(gè)月，而無甲基化的患者中位生存時(shí)間為53.5個(gè)月(見圖1)。

3 討 論

lgr5是一種獨(dú)立的G蛋白偶聯(lián)受體分子，屬于G蛋白偶聯(lián)激素受體家族一員，基因中包含了豐富色氨酸重復(fù)序列，也被稱作G蛋白偶聯(lián)受體49 (GPR49)[10]。與cyclinD1和c-myc類似，lgr5也被認(rèn)為是受WNT信號(hào)途徑調(diào)節(jié)的靶基因之一。許多研究也證實(shí)lgr5在多種腫瘤中表達(dá)升高，如肝細(xì)胞癌、皮膚基底細(xì)胞癌等[3,5]。在結(jié)腸癌細(xì)胞中，采用siRNA干擾技術(shù)敲出lgr5會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,相反，過表達(dá)lgr5可以促進(jìn)結(jié)腸腫瘤細(xì)胞增殖，增強(qiáng)細(xì)胞致瘤能力[1,2]。最近有研究表明lgr5可以作為結(jié)腸腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志[11]。另外有研究也發(fā)現(xiàn)lgr5在卵巢癌組織高表達(dá)(53%)，并且與腫瘤Ⅲ～Ⅳ相關(guān)[4]。DNA甲基化被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生過程中一種非常重要的表觀修飾方式[8]。多種基因如BRAC1等在卵巢癌中高甲基化可以促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展，并且與腫瘤的病理分期或轉(zhuǎn)移相關(guān)[12]。

在本研究中，我們采用lgr5啟動(dòng)子區(qū)特異的甲基化引物分析lgr5在卵巢癌中的甲基化狀態(tài)，證實(shí)了lgr5甲基化從正常組織到上皮性卵巢癌過程中明顯升高，并且在良性腫瘤中也有少量改變，盡管統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有明顯差異，但這可以提示lgr5甲基化可能是癌變?cè)缙诘囊粋€(gè)分子信號(hào)。另外，我們也檢測(cè)了lgr5與上皮性卵巢癌臨床病理之間的聯(lián)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lgr5與腫瘤組織類型無關(guān)，但與腫瘤的分化、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，從而證實(shí)了lgr5甲基化有助于判定腫瘤低分化，并且可以作為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一種分子標(biāo)志。 我們進(jìn)一步回顧性分析了lgr5甲基化與上皮卵巢癌患者5年總的生存率之間的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)在有l(wèi)gr5甲基化的患者與無甲基化的患者比較而言，總的生存率明顯下降。由于我們所選樣本并不能代表整個(gè)卵巢癌患者群體，所以lgr5甲基化作為一種判斷預(yù)后生存指標(biāo)的價(jià)值還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行證實(shí)。

綜上所述，我們認(rèn)為在卵巢癌組織中，lgr5啟動(dòng)子區(qū)存在高甲基化狀態(tài)，并且與上皮性卵巢癌臨床分期Ⅲ～Ⅳ、低分化以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，同時(shí)也論證了lgr5甲基化可以作為判斷上皮性卵巢癌患者總的預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)。盡管如此，lgr5甲基化致瘤和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)制還需要深入研究，以便為卵巢癌分子生物治療提供一個(gè)新的探索方向。

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[編輯] 一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2012.10.003

2012-09-02

湖北省衛(wèi)生廳科研基金指導(dǎo)性項(xiàng)目(JX3C54)

費(fèi)夢(mèng)(1979-)，女，湖北荊州人，主治醫(yī)師，碩士，主要從事婦產(chǎn)科臨床與研究工作。

R737.31

A

1673-1409(2012)10-R006-03