豚鼠經(jīng)典眨眼條件反射雙任務(wù)模型的建立

尚經(jīng)軒 虞 璟 隋建峰 范 蕊 虞樂華 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院康復(fù)理療中心，重慶 40000)

豚鼠經(jīng)典眨眼條件反射雙任務(wù)模型的建立

尚經(jīng)軒1虞 璟2隋建峰3范 蕊 虞樂華 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院康復(fù)理療中心，重慶 400010)

目的 在同一豚鼠體上建立痕跡性和延遲性眨眼條件反射雙任務(wù)模型，為研究認(rèn)知過程中前額葉與其他腦區(qū)信息編碼機(jī)制提供模型。方法 以經(jīng)典的眨眼條件反射為基礎(chǔ)，采用1 kHz和3 kHz正弦波純音分別配對壓強(qiáng)為20 kPa的束狀氧氣流對豚鼠左側(cè)眼角膜進(jìn)行刺激，利用肌肉張力換能器采集豚鼠眨眼活動，用眨眼條件反射行為特征傳感器信號分析軟件V2.2版分析眨眼數(shù)據(jù)。結(jié)果 經(jīng)過10 d的配對訓(xùn)練后，6只豚鼠均建立了痕跡性和延遲性眨眼條件反射雙任務(wù)。實驗發(fā)現(xiàn)，與痕跡性眨眼條件反射相比，豚鼠更容易建立延遲性眨眼條件反射。結(jié)論 利用同一豚鼠首次成功建立了痕跡性和延遲性眨眼條件反射雙行為模型。

痕跡性眨眼條件反射;延遲性眨眼條件反射;雙任務(wù)模型

經(jīng)典眨眼條件反射(EBC)一直是研究聯(lián)合型學(xué)習(xí)記憶神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制的重要模型〔1，2〕。其基本訓(xùn)練過程是：條件刺激(CS，如聲音或光)與非條件刺激(US，如向角膜吹氣或眶周電擊)反復(fù)配對呈現(xiàn)，訓(xùn)練動物學(xué)會對條件刺激產(chǎn)生行為條件反應(yīng)(CR)。根據(jù)該反射訓(xùn)練時條件刺激與非條件刺激之間的時間關(guān)系的不同，EBC又分為延遲性眨眼條件反射(DEBC)和痕跡性眨眼條件反射(TEBC)。所謂DEBC是指：條件刺激的起點(diǎn)與非條件刺激的起點(diǎn)有一定時間間隔，即US在CS出現(xiàn)之后延遲一定時間才出現(xiàn)，但與CS同時終止;與DEBC相比，TEBC的最大不同點(diǎn)是CS的終點(diǎn)與US的起點(diǎn)之間有段無任何刺激的時間間隔。前額葉在眨眼條件反射中的作用成為研究的熱點(diǎn)，需要建立TEBC和DEBC模型，分析在學(xué)習(xí)與記憶中前額葉與其他結(jié)構(gòu)的作用關(guān)系〔3〕。目前有學(xué)者利用豚鼠成功建立了聽覺識別訓(xùn)練模型，采用CS與US配對分別刺激兩組豚鼠成功建立TEBC和DEBC，但實驗結(jié)果往往會受動物狀態(tài)等因素的干擾〔4，5〕。因此，在同一豚鼠體上建立 TEBC和 DEBC雙任務(wù)模型，對于應(yīng)用EBC準(zhǔn)確分析前額葉在認(rèn)知過程中的作用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用健康8～10周齡雄性英國種白化豚鼠6只，350～450 g/只，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于溫度為20℃ ～25℃的動物室內(nèi)，24 h循環(huán)燈照，自由進(jìn)食、飲水，并適當(dāng)給予維生素C補(bǔ)充。在飼養(yǎng)籠內(nèi)鋪以木屑，以保持環(huán)境干燥。實驗在上午9：00～下午5：00進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠頭部小型頭顱固定裝置的安裝 用1%戊巴比妥鈉(0.1 ml/100 g，腹腔注射)和速眠新Ⅱ(0.1 ml，肌肉注射)復(fù)合麻醉動物，并將其頭部固定于腦立體定向儀上(SR-6N，Narishige，Japan)。常規(guī)消毒后，沿顱骨中線切開皮膚和皮下組織，切開范圍為眼后至耳間的區(qū)域。在暴露的顱骨上鉆開4個直徑約1.0 mm的小孔(坐標(biāo)：孔1和2：前囟后2.0 mm，雙側(cè)旁開2.0 mm;孔3和4：前囟后12.0 mm，雙側(cè)旁開2.0 mm)。分別用4顆已消毒的不銹鋼螺絲釘(直徑：1.0 mm，螺距：400 μm，重量：0.3 g)反旋入1～4號小孔內(nèi)。將矩形頭部固定支架(大?。?.0 cm×1.0 cm×0.4 cm;材料：有機(jī)玻璃，重量：0.5 g)嵌合在1～4孔不銹鋼螺絲之間，后用502強(qiáng)力膠拌牙科水泥固定。術(shù)后給予必要的抗感染措施?；謴?fù)1 w后，全身和眨眼狀況恢復(fù)良好的動物進(jìn)行行為訓(xùn)練。

1.2.2 行為訓(xùn)練方法 行為訓(xùn)練在隔光、隔音的屏蔽柜內(nèi)進(jìn)行，保持實驗環(huán)境處于安靜狀態(tài)。完整的訓(xùn)練周期包括2 d適應(yīng)期和10 d訓(xùn)練期。適應(yīng)期內(nèi)，豚鼠被放置于有機(jī)玻璃制成的長方體固定盒(20 cm×8 cm×5 cm)中，通過固定盒前端孔洞將其頭頸部露在盒外，使用耳桿頂住頭顱固定支架，將豚鼠頭部固定在腦立體定位儀上。適應(yīng)時間約50 min，在此期間不給動物施予任何刺激。

行為訓(xùn)練在適應(yīng)期結(jié)束后第1天開始，每天每只訓(xùn)練一次，連續(xù)進(jìn)行10 d，豚鼠固定方法同適應(yīng)期。將氣流噴嘴放置于正對豚鼠左側(cè)眼角膜的位置，距離1.0 cm。非條件刺激(US)為一個持續(xù)100 ms、壓強(qiáng)為20 kPa的束狀氧氣流;條件刺激(CS)為持續(xù)500 ms的1kHz低頻聲和持續(xù)300 ms的3 kHz高頻聲組成的正弦波純音(聲壓強(qiáng)度：80～90 dB;升降時間：5 ms)。高頻聲(H-CS)70次，H-CS約占刺激總數(shù)的50%左右，低頻聲(L-CS)次數(shù)隨機(jī)。高、低頻聲隨機(jī)出現(xiàn)，由靜電揚(yáng)聲器播放，并可觸發(fā)“SBO-1條件反射與識別學(xué)習(xí)行為自動訓(xùn)練系統(tǒng)”，按照設(shè)定的參數(shù)釋放氧氣流，具體的訓(xùn)練流程見圖1。

圖1 雙任務(wù)訓(xùn)練流程示意圖

DEBC配對訓(xùn)練時，低頻聲CS開始400 ms后，對左眼角膜施予US，CS和US同時結(jié)束;而在TEBC配對訓(xùn)練時高頻聲CS開始600 ms后，對左眼角膜施予US。每只動物每天訓(xùn)練1次，每次配對訓(xùn)練間隔時間為15～30 s(平均為20 s)。

1.2.3 眼輪匝肌活動記錄 訓(xùn)練時，末端帶有尼龍細(xì)線的蛙心夾夾住豚鼠左側(cè)上眼瞼，尼龍細(xì)線另一端連接肌肉張力換能器。眨眼活動引起的張力變化轉(zhuǎn)換為電位波動，可以反映左側(cè)上眼瞼的活動情況(1 mV電位波動與0.25 mm眨眼幅度變化對應(yīng))。眨眼活動信號、CS信號由多通道電生理信號記錄儀同步記錄，采樣頻率為20 kHz，數(shù)字信號存儲于控制的電腦中。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 使用眨眼條件反射行為特征傳感器信號分析軟件V2.2版分析存儲于電腦中的眨眼數(shù)字信號。顯著的眨眼活動滿足以下2個標(biāo)準(zhǔn)：①上眼瞼活動值(時刻t)≥眼瞼活動基線值+1 mV;②滿足條件①的時間總和超過15 ms。眨眼反應(yīng)參數(shù)定義：條件性眨眼反應(yīng)(CR)：在DEBC配對訓(xùn)練模式中CS開始后200～400 ms階段發(fā)生的顯著眨眼活動;在TEBC配對訓(xùn)練模式中CS開始后400～600 ms階段發(fā)生的顯著眨眼活動。驚愕反應(yīng)(SR)為由于聲音而產(chǎn)生的驚愕反應(yīng)，其定義為CS開始后35～100 ms階段發(fā)生的顯著眨眼活動。非條件眨眼反應(yīng)(UR)定義為US開始后1～100 ms發(fā)生的顯著眨眼活動。眨眼反應(yīng)參數(shù)定義如下：①CR峰幅度：CR最大值與基線值之間的幅度間隔;②SR峰幅度：SR最大值與基線值之間的幅度間隔。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 豚鼠痕跡性和延遲性眨眼條件反射建立過程中眨眼反射圖像

痕跡性和延遲性眨眼條件反射建立過程中第1天的圖像對比：TEBC和DEBC都沒有建立，而在TEBC訓(xùn)練任務(wù)中SR反應(yīng)的峰幅度較高。見圖2。

痕跡性和延遲性眨眼條件反射建立過程中第10天的圖像對比：TEBC和DEBC習(xí)得率和峰幅度保持在高水平，建立了TEBC和DEBC;而在TEBC中SR出現(xiàn)率及峰幅度與DEBC的相比，始終保持在高水平。見圖3。

圖2 第1天TEBC和DEBC訓(xùn)練

圖3 在第10天TEBC和DEBC訓(xùn)練

2.2 痕跡性和延遲性眨眼條件反射建立過程中各項參數(shù)的動態(tài)變化

2.2.1 CR習(xí)得率 在痕跡性眨眼條件反射訓(xùn)練的第1～10天，CR習(xí)得率隨訓(xùn)練天數(shù)的增加而逐漸增加，訓(xùn)練第10天CR習(xí)得率〔(84.87±4.09)%〕顯著高于訓(xùn)練的第一天〔(5.55±2.89)%〕(P＜0.05);同樣，在延遲性眨眼條件反射訓(xùn)練的第1～10天，CR習(xí)得率隨訓(xùn)練天數(shù)的增加而逐漸增加，訓(xùn)練第10天CR習(xí)得率〔(91.77±1.18)%〕顯著高于訓(xùn)練的第1天〔(7.25±2.32)%〕(P＜0.05)。DEBC習(xí)得率顯著高于TEBC習(xí)得率(P＜0.05)。見圖4。

圖4TEBC和DEBC CR習(xí)得率動態(tài)變化

2.2.2 CR峰幅度 在痕跡性眨眼條件反射訓(xùn)練的第1～10天，CR峰幅度隨訓(xùn)練天數(shù)的增加而逐漸升高，訓(xùn)練第10天CR峰幅度〔(3.08±0.25)mV〕顯著高于訓(xùn)練第一天的峰幅度〔(1.23±0.45)mV〕(P＜0.05);同樣，在延遲性眨眼條件反射訓(xùn)練的第1～10天，CR峰幅度隨訓(xùn)練天數(shù)的增加而逐漸升高，訓(xùn)練第10天CR峰幅度〔(3.20±0.30)mV〕顯著高于訓(xùn)練第一天的峰幅度〔(1.60±0.38)mV〕(P＜0.05)。TEBC和DEBC的峰幅度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.638)。見圖5。

圖5TEBC和DEBC CR峰幅度動態(tài)變化

2.2.3 SR出現(xiàn)率 在痕跡性眨眼條件反射訓(xùn)練的第1～10天，SR出現(xiàn)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.334);在延遲性眨眼條件反射建立過程中，SR出現(xiàn)率也無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.352)。TEBC中SR的出現(xiàn)率顯著高于DEBC(P＜0.05)。見圖6。

2.2.4 SR峰幅度 在痕跡性眨眼條件反射訓(xùn)練的第1～10天，SR峰幅度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.841);同樣，在延遲性眨眼條件反射訓(xùn)練的第1～10天，SR峰幅度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.891)。TEBC中SR的峰幅度顯著高于DEBC(P＜0.05)。見圖7。

圖6 TEBC和DEBC SR出現(xiàn)率動態(tài)變化

圖7TEBC和DEBC中SR峰幅度動態(tài)變化

3 討論

為了闡明學(xué)習(xí)與記憶發(fā)生的神經(jīng)機(jī)制、信息編碼過程，需要動物行為實驗?zāi)Ｐ蛠硌芯窟@一腦認(rèn)知功能過程〔6〕。有文獻(xiàn)報道，DEBC建立依賴于小腦結(jié)構(gòu)，TEBC的建立還需要其他結(jié)構(gòu)(海馬、前額葉等)參與〔7〕。

與大鼠相比，豚鼠性情溫順，便于使用頭顱固定眨眼訓(xùn)練裝置，無刺激時幾乎沒有自主眨眼，本實驗前期已成功建立了豚鼠經(jīng)典眨眼條件反射模型〔5〕。因此，本實驗采用豚鼠，意在同一動物體上建立痕跡性和延遲性眨眼條件反射雙任務(wù)模型，為探索前額葉在學(xué)習(xí)與記憶中神經(jīng)元活動信息編碼機(jī)制提供有用的動物模型。目前，尚未見相關(guān)研究報道。

本研究結(jié)果顯示：①經(jīng)過連續(xù)10 d的CS與US配對訓(xùn)練，每只豚鼠均可以習(xí)得TEBC和DEBC，且兩組CR習(xí)得率隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加而增加;但它們更容易習(xí)得DEBC，表現(xiàn)在其有較高的CR習(xí)得率和較快的習(xí)得速度，這與在大鼠、小鼠以及人等受試動物上的發(fā)現(xiàn)相似，也與利用豚鼠進(jìn)行TEBC、DEBC單任務(wù)訓(xùn)練結(jié)果一致〔6〕。②在TEBC和DEBC訓(xùn)練中兩組CR的峰幅度隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加而上升，但TEBC和DEBC的CR峰幅度差異不顯著。③在TEBC和DEBC雙任務(wù)建立中，SR發(fā)生率及峰幅度存在差異，表現(xiàn)在TEBC的SR發(fā)生率及峰幅度都高于DEBC的發(fā)生率和峰幅度，提示SR和CR可能是由不同神經(jīng)環(huán)路或神經(jīng)機(jī)制介導(dǎo)的。更復(fù)雜的纖維輸入方式和途徑可能是建立TEBC所需要的訓(xùn)練次數(shù)要多于DEBC的原因〔3～7〕。

在同一豚鼠體上建立TEBC和DEBC雙任務(wù)模型很好地消除了實驗動物的影響，準(zhǔn)確地反映出動物對訓(xùn)練任務(wù)的學(xué)習(xí)情況;同時，進(jìn)行兩種訓(xùn)練任務(wù)也節(jié)省了訓(xùn)練時間，減少了實驗對動物的需要量?？傊浑嗍篌w上可以建立TEBC和DEBC雙任務(wù)模型。

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3 Kalmbach BE，Tatsuya O，Joy C，et al.Interactions between prefrontal cortex and cerebellum revealed by trace eyelid conditioning〔J〕.Learn Mem，2009;16(1)：86-95.

4 黃率帥，林 曦，胡 波，等.經(jīng)典眨眼條件反射建立后豚鼠小腦齒狀-中位核突觸超微結(jié)構(gòu)的變化〔J〕.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2009;31(6)：477-9.

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Establishment of a dual task model of classical eyeblink conditioning in guinea pigs

SHANG Jing-Xuan，YU Jing，SUI Jian-Feng，et al.
Center of Physical Medicine and Rehabilitation，Second Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400010，China

Objective To establish a dual task model of trace and delay eyeblink conditioning in the same guinea pigs，which offering a model for the relationship study of the frontal cortex and other brain regions in cognitive process.Methods On the basis of the classical eyeblink conditioning，1 kHz and 3 kHz tone conditioned stimulus(CS)were separately paired with a 20 kPa corneal oxygen-puff unconditioned stimulus(US)to stimulate the left cornea of the guinea pigs.Blink activity in guinea pig was collected with muscle tension transducer，and eyeblink conditioning behavior feature sensor signal analyzing software V2.2 was used to analyze the data of eyeblink.Results After 10 days'paring training，all 6 guinea pigs had established the dual task model of trace and delay eyeblink conditioning.Compared to trace eyeblink conditioning，it was easier for the guinea pigs to establish delay eyeblink conditioning.Conclusions It is first reported that the same guinea pigs could also obtain trace and delay eyeblink conditioning，which provides a reliable model for studying the exact role of prefrontal cortex in the cognitive processes.

Trace eyeblink conditioning;Delay eyeblink conditioning;Dual task model

R338.61

〕 A

1005-9202(2012)22-4925-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.22.034

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30771769)

1 重慶城市管理職業(yè)學(xué)院 2 重慶醫(yī)科大學(xué)臨床學(xué)院

3 第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部生理學(xué)教研室

虞樂華(1963-)，男，主任醫(yī)師，教授，博士，主要從事物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)科學(xué)的研究。

尚經(jīng)軒(1977-)，男，講師，碩士，主要從事物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)科學(xué)的研究。

〔2011-10-10收稿 2011-12-12修回〕

(編輯 曲 莉)