自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療腦梗死后遺癥30例

詹三華 張魯峰 姚衛(wèi)民 宋曉玲 劉林源 (武警河南省總隊(duì)醫(yī)院普內(nèi)科，河南 鄭州 450052)

腦梗死后遺癥是腦血管疾病引起的一種頑固性疾病，對(duì)腦梗死后遺癥的病人，臨床治療應(yīng)用中藥治療、針灸、理療等，療效甚微。隨著干細(xì)胞臨床應(yīng)用技術(shù)的研究，通過干細(xì)胞移植治療腦梗死后遺癥，給腦梗死的治療帶來了突破性進(jìn)展。本文重點(diǎn)研究自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)經(jīng)腰穿移植治療腦梗死后遺癥的療效和安全性。

1 對(duì)象與方法

1.1 臨床資料 2010～2011年我院30例腦梗死后遺癥患者武警河南省總隊(duì)醫(yī)院普內(nèi)科，年齡42～78歲，平均59歲;病程1.5～10.5年，平均4.5年。上述患者均經(jīng)過頭顱CT和磁共振檢查確診。

1.2 術(shù)前準(zhǔn)備 術(shù)前8 h禁食，4 h禁水，移植當(dāng)日對(duì)患者進(jìn)行隔離，骨髓穿刺術(shù)前5 h進(jìn)行房間消毒。

1.3 骨髓采集 在無菌條件下，局部麻醉消毒，取髂后上棘為穿刺點(diǎn)，以30號(hào)骨髓穿刺針穿刺，抽骨髓140～190 ml，肝素抗凝。

1.4 BMSCs分離和培養(yǎng) 分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞步驟如下：(1)用無菌接口機(jī)將采集骨髓采血袋和一個(gè)50 ml一次性無菌塑料血袋相連。(2)離心，2 400 r/min，5 min，將血漿轉(zhuǎn)移至50 ml一次性無菌塑料血袋內(nèi)。(3)加入無菌PBS至紅細(xì)胞懸液內(nèi)等倍稀釋。(4)將淋巴細(xì)胞分離液轉(zhuǎn)移至四聯(lián)袋主袋內(nèi)。(5)等比例將稀釋的骨髓血緩緩加入盛有淋巴細(xì)胞分離液的主袋內(nèi)，以1 900 r/min，離心20 min。(6)主袋內(nèi)液體自上而下分為5層，白膜層轉(zhuǎn)移到另一成品袋內(nèi)，此袋即為富集骨髓單個(gè)核細(xì)胞。(7)以2 500 r/min、離心5 min，生理鹽水重復(fù)洗滌2次。經(jīng)上述步驟分離出骨髓單個(gè)核細(xì)胞，將細(xì)胞加入體積比DME∶F12為1∶1的DMEM/F12培養(yǎng)基裝于75 ml培養(yǎng)瓶中，置于37℃，飽和濕度體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)4 d，收集細(xì)胞，用生理鹽水懸浮4 ml，進(jìn)行BMSCs移植術(shù)。分離的骨髓單個(gè)核細(xì)胞呈懸浮樣、小圓形，4 d后胞質(zhì)豐富，核大且核仁明顯，克隆團(tuán)樣生長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量明顯增多(圖1)。

1.5 移植方法 經(jīng)腰穿注射至蛛網(wǎng)膜下腔(移植前，患者及家屬簽署治療同意書，該研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意批準(zhǔn))。

1.6 療效標(biāo)準(zhǔn) 痊愈：生活自理或正常工作，運(yùn)動(dòng)恢復(fù)正常，肢體感覺及語言恢復(fù)正常，1年隨訪未復(fù)發(fā);顯效：生活基本自理，運(yùn)動(dòng)、肢體感覺基本恢復(fù)，語言無障礙，1年隨訪未復(fù)發(fā);好轉(zhuǎn)：生活部分自理，活動(dòng)、肢體感覺有所改善，語言一定恢復(fù)，1年隨訪較穩(wěn)定;無效：生活仍不能自理，治療前后癥狀無改善。

1.7 結(jié)果 總有效率86.7%，其中生活基本自理，體征和癥狀明顯改善11例，為顯效;生活部分自理，癥狀和體征有所改善15例，為好轉(zhuǎn);4例體征和癥狀無變化，為無效。未見不良反應(yīng)及并發(fā)癥發(fā)生。

圖1 BMSCs培養(yǎng)4 d(×200)

2 討論

腦梗死是導(dǎo)致成人殘疾第一位疾病，也是第三位導(dǎo)致人類死亡的疾病，僅次于心血管疾病和惡性腫瘤。我國(guó)每年發(fā)生腦梗死的病人在100萬人以上，其中約1/3的人失去勞動(dòng)能力。腦梗死后遺癥使患者肢體殘疾，智力、語言障礙，成為嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)難題和社會(huì)問題。腦梗死后遺癥的治療取決于兩個(gè)因素，第一、充分的發(fā)揮中樞系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)重構(gòu)和功能重組，也就是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性;第二、梗死腦組織的吸收，側(cè)支循環(huán)的建立，血管再通。在一定條件下BMSCS能夠進(jìn)行增殖，具有自我更新和多分化潛能，替代受損的神經(jīng)細(xì)胞，達(dá)到治療腦梗死后遺癥的目的。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，BMSCs大部分移行至缺血皮質(zhì)邊緣〔1〕，而缺血對(duì)側(cè)相應(yīng)部位BMSCs相對(duì)減少。側(cè)腦室中局部注射BMSCs，能夠遷移至缺血部位分化為神經(jīng)元。BMSCs增加神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量，能改善神經(jīng)功能狀況，從而使腦梗死后遺癥得到改善。通過腦脊液移植有二種方法，第一、在CT定位下做第四腦室或側(cè)腦室穿刺注入的方法;第二、腰穿注射蛛網(wǎng)膜下腔。兩種方法在雙側(cè)大腦半球均發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞蹤跡，BMSCs通過腦脊液的流動(dòng)遷移到缺血損傷部位，使認(rèn)知功能、語言功能，肢體運(yùn)動(dòng)功能明顯改善。BMSCs是治療腦梗死后遺癥的理想種子細(xì)胞，替代中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病功能受損的神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。用BMSCs治療腦梗死，生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子增加和腦膠質(zhì)細(xì)胞活化與神經(jīng)功能的恢復(fù)相關(guān)〔1，2〕。BMSCs促進(jìn)神經(jīng)元的功能恢復(fù)和新的血管生成，同時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖。BMSCs來自中胚層，主要存在于器官間質(zhì)和全身結(jié)締組織，其中骨髓組織中含量最多，具有多向分化能力，可以分化為骨、肌肉、軟骨、神經(jīng)等組織細(xì)胞〔3，4〕。BMSCs 擴(kuò)增能力強(qiáng)免疫原性低，而且取材方便，具有多向分化潛能，合成細(xì)胞外基質(zhì)，包括Ⅳ型膠原蛋白、白細(xì)胞介素(IL)-8、干細(xì)胞因子、集落刺激因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、IL-11及造血調(diào)節(jié)分子等。IL-11對(duì)造血細(xì)胞和非造血細(xì)胞有多種作用，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其分布于齒狀回顆粒細(xì)胞層、海馬錐體細(xì)胞層、脊髓前角和側(cè)角神經(jīng)元。BMSCs通過分泌各種細(xì)胞因子促進(jìn)神經(jīng)組織功能改善和神經(jīng)系統(tǒng)自我修復(fù)〔5，6〕。

1 翁金森，劉 楠，杜厚偉，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)腦梗塞大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)及突觸素表達(dá)的影響〔J〕.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2008;24(1)：34-7.

2 Yu X，Chen D，Zhang Y，et al.Overexpression of CXCR4 in mesenchymal stem cells promotes migration，neuroprotection and angiogenesis in a rat model of stroke〔J〕.J Neurol Sci，2012;316(1-2)：141-9.

3 Xu H，Miki K，Ishibashi S，et al.Transplantation of neuronal cells induced from human mesenchymal stem cells improves neurological functions after stroke without cell fusion〔J〕.J Neurosci Res，2010;88(16)：3598-609.

4 Komatsu K，Honmou O，Suzuki J，et al.Therapeutic time window of mesenchymal stem cells derived from bone marrow after cerebral ischemia〔J〕.Brain Res，2010;1334：84-92.

5 Toyama K，Honmou O，Harada K，et al.Therapeutic benefits of angiogenetic gene-modified human mesenchymal stem cells after cerebral ischemia〔J〕.Exp Neurol，2009;216(1)：47-55.

6 Ikehara S.Bone marrow transplantation：a new strategy for intractable diseases〔J〕.Drugs Today(Barc)，2002;38(2)：103-11.