法舒地爾對(duì)家兔脊髓缺血再灌注損傷的影響

周青珍 閻平建 韓 琦 王 崢 佟德華 胡 博

脊髓損傷作為嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病往往導(dǎo)致肢體截癱、肢體感覺(jué)及括約肌功能障礙等，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，甚至導(dǎo)致呼吸肌麻痹而危及生命，給個(gè)人、家庭及社會(huì)帶來(lái)極大的痛苦與沉重的負(fù)擔(dān)。過(guò)度的炎性反應(yīng)是脊髓損傷的重要環(huán)節(jié)，法舒地爾是Rho激酶特異性抑制劑，具有明顯的抗腦缺血及再灌注損傷作用［1～4］，但很少有脊髓缺血再灌注損傷方面的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在成功建立脊髓缺血再灌注損傷模型基礎(chǔ)上，探討法舒地爾對(duì)ICAM－1表達(dá)水平的影響及對(duì)脊髓缺血及再灌注損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 普通級(jí)日本大耳兔42只，雌雄不限，體重2～2.5 kg，由武漢生物制品研究所提供。

1.1.2 試劑與儀器 法舒地爾購(gòu)自天津紅日藥業(yè)股份有限公司；細(xì)胞間粘附分子－1（ICAM－1）多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Molecular Tag分子標(biāo)記公司；免疫組化二抗染色試劑盒及DAB顯色試劑盒購(gòu)自美國(guó)ZYMED 公司；肌電圖機(jī)購(gòu)自丹麥維迪公司，型號(hào)：KEYTOINT。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型制備

42只家兔隨機(jī)分為3組，即假手術(shù)組（n＝6）、模型組（n＝18）、法舒地爾組（n＝18），對(duì)模型組及法舒地爾組采用腹主動(dòng)脈夾閉法［5］制作脊髓缺血再灌注模型：無(wú)菌條件下，采用仰臥位腹部正中切口，手術(shù)分離家兔腹主動(dòng)脈，在左腎動(dòng)脈分支起始部下方用動(dòng)脈夾夾閉腹主動(dòng)脈，45 min后取下動(dòng)脈夾實(shí)現(xiàn)再灌注。根據(jù)再灌注時(shí)間又分為再灌注后3 d，7 d，14 d三個(gè)亞組（n＝6）；法舒地爾組術(shù)后每日腹腔注射法舒地爾10 mg／kg，模型組注射等量生理鹽水，假手術(shù)組不予干預(yù)。于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死家兔，取損傷脊髓，固定備用。假手術(shù)組3 d時(shí)麻醉處死取脊髓標(biāo)本。

1.2.2 神經(jīng)功能評(píng)分 術(shù)后立即對(duì)家兔按照J(rèn)acobs法［6］行后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)級(jí)，具體標(biāo)準(zhǔn)為0 級(jí)：全癱（針刺無(wú)反應(yīng)）；1級(jí)：嚴(yán)重癱瘓，最小功能性運(yùn)動(dòng)（肌肉搐動(dòng)）；2級(jí)：能進(jìn)行功能性運(yùn)動(dòng)（受累肢體可負(fù)重），但不能齊足跳動(dòng)，而有共濟(jì)失調(diào)和輕癱（跛行）；3級(jí)：能齊足跳動(dòng)，但有共濟(jì)失調(diào)和輕癱；4級(jí)：齊足跳動(dòng)、輕度共濟(jì)失調(diào)和（或）輕癱（奔跑但不夠靈活）；5級(jí)：正常。實(shí)驗(yàn)前后運(yùn)用肌電圖分別對(duì)家兔進(jìn)行后肢運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位（motor evoked potential MEP）潛伏期（P1）檢測(cè)，記錄電極安放在顱骨正中矢狀線旁開(kāi)4.0mm，冠狀線下2.5 mm，刺激電極插入腓腸肌，刺激強(qiáng)度5 mA，頻率4 Hz，波寬1.0ms的單方波。

1.2.3 ICAM－1免疫組化染色 家兔缺血45 min再灌注3 d，7 d及14 d時(shí)，評(píng)級(jí)及檢測(cè)肌電圖后麻醉并處死家兔，取損傷L1－L5 脊髓，固定，石蠟包埋，制備5μm 厚連續(xù)切片，按免疫組化ABC 步驟進(jìn)行。每張切片隨機(jī)采集5個(gè)400倍視野輸入圖像分析系統(tǒng)，觀察ICAM－1陽(yáng)性表達(dá)水平。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)脊髓缺血再灌注家兔神經(jīng)缺失的影響

脊髓缺血灌注損傷后模型組家兔Jacobs評(píng)分與假手術(shù)組相比明顯降低（P＜0.001），7 d亞組神經(jīng)功能缺損最重；法舒地爾組家兔Jacobs評(píng)分與模型組相比明顯升高（P＜0.01），而3 d、7 d、14 d三個(gè)亞組之間Jacobs評(píng)分相比差異明顯（P＜0.05）（見(jiàn)表1）。

表1 各組家兔后肢Jacobs評(píng)分的影響（±s，n＝6，分）

表1 各組家兔后肢Jacobs評(píng)分的影響（±s，n＝6，分）

組別 Jacobs評(píng)分3 d 7 d 14d假手術(shù)組 5.00±0.00模型組 1.50±0.55 1.17±0.75 1.50±0.54法舒地爾組 2.00±0.63 2.17±0.75 2.67±1.03

2.2 對(duì)后肢運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位的影響

治療后模型組及法舒地爾組運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位潛伏期P1較治療前明顯縮短（P＜0.001），（表2）。

表2 法舒地爾對(duì)運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位的影響（±s，n＝18，s）

表2 法舒地爾對(duì)運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位的影響（±s，n＝18，s）

組別 潛伏期P1治療前 治療后模型組 39.28±4.19 52.92±3.01法舒地爾組 38.22±5.50 44.74±5.16

2.3 對(duì)脊髓ICAM－1表達(dá)水平的影響

ICAM－1蛋白陽(yáng)性染色為棕黃色，主要分布在微血管和毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞。假手術(shù)組家兔脊髓血管內(nèi)皮僅有微量的ICAM－1表達(dá)，模型組脊髓血管內(nèi)皮ICAM－1表達(dá)明顯增強(qiáng)，陽(yáng)性血管數(shù)明顯增多（P＜0.01），以7 d時(shí)表達(dá)最明顯；與模型組相比，法舒地爾組脊髓ICAM－1表達(dá)相對(duì)減弱，陽(yáng)性血管數(shù)相對(duì)減少（P＜0.01）（圖1～3、表3）。

圖1 假手術(shù)組（×400）

圖2 模型組（×400）

圖3 法舒地爾組（×400）

3 討 論

脊髓缺血再灌注損傷后，與再灌注有關(guān)的急性炎癥反應(yīng)在繼發(fā)性脊髓損傷中的作用日益受到重視［7］，細(xì)胞粘附分子是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類細(xì)胞表面的糖蛋白，參與正常組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)的維持，影響內(nèi)皮細(xì)胞之間的連接以及細(xì)胞－基底膜之間的粘附，保證內(nèi)皮細(xì)胞層的連續(xù)性通透屏障功能［8，9］。在機(jī)體免疫、炎癥反應(yīng)中粘附分子介導(dǎo)了白細(xì)胞的粘附和活化。血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的粘附分子包括ICAM－1，ICAM－2等，它們的表達(dá)與白細(xì)胞粘附到血管壁以及穿越內(nèi)皮細(xì)胞現(xiàn)象有關(guān)。其中ICAM－1為比較重要的粘附分子，作為白細(xì)胞表面粘附分子CD11／CD18系統(tǒng)的配體，炎癥時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞ICAM－1 表達(dá)量的升高介導(dǎo)了白細(xì)胞的活化及其與血管壁的緊密粘附，為白細(xì)胞進(jìn)一步跨內(nèi)皮游出提供了條件。正常情況下ICAM－1僅在脊髓微血管內(nèi)皮細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞低表達(dá)，但在一些炎癥遞質(zhì)刺激下它們?cè)谘軆?nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)明顯升高。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在家兔脊髓缺血再灌注3 d時(shí)ICAM－1表達(dá)明顯升高，在7 d時(shí)達(dá)高峰，在14 d時(shí)仍有較高水平表達(dá)。與此相符，神經(jīng)功能缺損程度3 d時(shí)明顯加重，7 d時(shí)達(dá)高峰，14 d 時(shí)仍有部分功能障礙。這說(shuō)明ICAM－1的遲發(fā)表達(dá)增多，促進(jìn)白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、脊髓微循環(huán)障礙及血脊髓屏障通透性增加，加重脊髓損傷后缺血、水腫、炎癥病理過(guò)程。

法舒地爾是Rho激酶特異性抑制劑，能夠擴(kuò)張動(dòng)脈血管，拮抗細(xì)胞內(nèi)鈣離子抑制肌動(dòng)－肌球蛋白的相互作用，可有效降低炎性細(xì)胞分泌炎性因子（IFN－γ、IFN－α、IL－8、IL－1β），并可抑制炎性細(xì)胞粘附和浸潤(rùn)。此外，Rho 激酶抑制劑還可通過(guò)抑制caspase－3而抑制神經(jīng)元凋亡，甚至可以增加內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞分化增殖［10］。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，經(jīng)法舒地爾治療后ICAM－1表達(dá)明顯減少，后肢Jacobs評(píng)分較模型組明顯減輕，運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位潛伏期P1明顯縮短，隨時(shí)間延長(zhǎng)，治療組各亞組之間神經(jīng)功能缺損情況及ICAM－1表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示早期、足療程應(yīng)用法舒地爾治療可減少炎癥反應(yīng)，最終減輕神經(jīng)功能損害。法舒地爾對(duì)脊髓神經(jīng)功能的保護(hù)作用機(jī)制可能為（1）法舒地爾能增加eNOS的表達(dá)，舒張血管增加局部血流量，延緩缺血組織進(jìn)入不可逆的細(xì)胞死亡過(guò)程；（2）法舒地爾對(duì)缺血區(qū)神經(jīng)元有直接的保護(hù)作用；（3）法舒地爾可以改善缺血區(qū)的微循環(huán)功能；（4）法舒地爾可以抑制缺血區(qū)白細(xì)胞的滲出，減輕炎癥反應(yīng)對(duì)神經(jīng)組織造成的損傷。但是，經(jīng)治療家兔脊髓缺血／再灌注損傷14 d后仍有部分神經(jīng)功能缺損，這說(shuō)明脊髓缺血／再灌注后炎性反應(yīng)僅是導(dǎo)致神經(jīng)損傷的一種原因，仍有其他因素參與，有待進(jìn)一步研究。

1 Rikitake Y，Kim HH，Huang Z，et al.Inhibition of Rho kinase（ROCK）leads to increased cerebral blood flow and stroke protection.Stoke，2005，36（10）：2251－2257.

2 Yamashita K，Kotani Y，Nakajima Y，et al.Fasudil，a Rho kinase（ROCK）inhibitor，protects against ischemic neuronal damage in vitro and in vivo by acting directly on neurons.Brain Res，2007，1154：215－224.

3 Yagita Y，Kitagawa K，Sasaki T，et al.Rho－kinase activation in endothelial cells contributes to expansion of infarction after focal cerebral ischemia.J Neurosci Res，2007，85（11）：2460－2469.

4 Satoh S，Utsunomiya T，Tsurui K，et al.Pharmacological profile of hydroxy fasudil as a selective Rho kinase inhibitor on ischemic brain damage.Life Sci，2001，69（12）：1441－1453.

5 伍亞民，王正國(guó)，朱佩芳，等.缺血損傷脊髓運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位的變化及其意義.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，22：294－296.

6 Jacobs TP，Shohami E，Baze W，et al.Deteriorating stroke model：histopathology，edema，and eicosanoid changes following spinal cord ischemia in rabbits.Stroke，1987，18：741－750.

7 Ip WK，Wong CK，Lam CW，et al.Tumour necrosis factor－alphainduced expression of intercellular adhesion molecule－1 on human endothelio cells is mediated by the activation of nuclear factorkappaB pathway.Clin Exp Allergy，2003，33（2）：241－248.

8 Braasch DA.Liu Y，Corey DR.Antisense inhibition of gene expression in cells by oligonucleotides incorporating locked nucleic acids：effect of mRNA target sequence and chimera design Nucleic Acids Res，2002，30（23）：5160－5167.

9 Steidl U，Haas R，Kronenwett R.Intercellular adhesion molecular 1 on monocytes mediates adhesion as well as trans－endothelial migration and can be downregulated using antisense oligonucleotides Ann Hematol，2000，79（8）：414－423.

10 郭愛(ài)華，孟建中.特異性Rho激酶抑制劑防治缺血性疾病的臨床進(jìn)展.生物醫(yī)學(xué)工程研究，2010，29：202－205.