微透析活體采樣技術(shù)在運動醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用進展

楊東升 沈巧兒 劉曉莉

1 浙江工業(yè)大學(xué)體育科學(xué)研究中心（杭州310023）

2 北京師范大學(xué)體育與運動學(xué)院

微透析技術(shù)是新近發(fā)展起來的一種新的生物采樣方法，適合于深部組織器官的活體研究。由于該技術(shù)具有活體、實時、在線等特點，因此，該技術(shù)對于運動過程中的機體生物學(xué)變化實驗研究具有得天獨厚的優(yōu)勢，得到了運動醫(yī)學(xué)研究者的廣泛應(yīng)用。本文就微透析技術(shù)在運動醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的研究進展進行總結(jié)。

1 微透析活體采樣技術(shù)概述

微透析技術(shù)是新近發(fā)展起來的一種新的研究方法，適合于深部組織器官的活體研究。由于該技術(shù)具有活體、原位取樣、實時、在線等特點，能夠真正實現(xiàn)組織器官在活體狀態(tài)下的生物化學(xué)物質(zhì)濃度的動態(tài)檢測［1］。其不但可用于單部位的取樣，還可應(yīng)用于多部位連續(xù)取樣，長期取樣。因其取樣量小，對生物體內(nèi)的平衡干擾小，故其所得數(shù)據(jù)較為可靠。微透析采樣技術(shù)已有40多年的歷史，最初由Bito等［2］提出。隨后在Delgado等［3］研究中所采用的橫向透析裝置，已經(jīng)是比較成熟的微透析裝置。后來不斷有學(xué)者進行改進，逐漸形成了現(xiàn)在廣泛應(yīng)用的同心圓微透析技術(shù)。最初其主要被用于研究腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，后來應(yīng)用范圍不斷擴大，成為神經(jīng)生理學(xué)和神經(jīng)化學(xué)研究的重要工具之一。近十年來，微透析采樣技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)及臨床研究領(lǐng)域亦得到了廣泛的應(yīng)用，學(xué)者們采用此技術(shù)在活體取樣研究中取得了令人矚目的成就。而實驗采樣部位也不再局限于最初的腦組織，應(yīng)用于心、肝、小腸、腎、脾臟、胃、子宮、眼、睪丸、前列腺、耳朵、肌肉、骨骼、皮膚、乳腺、黃體和腹膜腔等幾乎所有的人體器官和組織的微透析研究都可見諸于報道［4］。此外，取樣研究對象也從實驗動物逐漸運用到了人體的組織和器官。

2 微透析技術(shù)的組成及原理

2.1 微透析技術(shù)裝置的組成

微透析技術(shù)所需的主要設(shè)備有微透析探針、連接管、微量灌流泵、樣品收集器和分析儀。其中微透析探針是微透析的核心部件，同心圓型探針是目前使用比較多的透析探針，其優(yōu)點是體積小，對腦組織損傷少，可通過預(yù)先埋置的引導(dǎo)管插入腦組織，為慢性實驗提供了方便。

2.2 微透析技術(shù)的原理

微透析采樣技術(shù)的原理與透析有關(guān)（圖1）。該技術(shù)將管狀透析裝置植入組織內(nèi)的特定部位，用組分與組織細(xì)胞外液相類似的溶液持續(xù)灌流。由于組織內(nèi)小分子物質(zhì)與透析半透膜內(nèi)的灌流溶液存在濃度差，這些小分子物質(zhì)就會跨膜擴散，而且由于灌流液不斷更新、流動，膜內(nèi)外濃度差始終存在，即構(gòu)成了物質(zhì)分子不斷地從組織細(xì)胞外液向透析溶液擴散的基礎(chǔ)。因此，透析液的物質(zhì)濃度也就可以反映出機體組織胞外液的待測物質(zhì)的變化，從而達到對組織某些化學(xué)物質(zhì)動態(tài)變化進行實時在線檢測的目的。

3 微透析技術(shù)在運動醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀

隨著微透析技術(shù)在神經(jīng)生理學(xué)以及神經(jīng)藥理學(xué)和臨床的廣泛應(yīng)用，運動醫(yī)學(xué)的研究工作者也開始關(guān)注此項技術(shù)。最早將此技術(shù)應(yīng)用于運動領(lǐng)域的研究始于上個世紀(jì)90年代。隨后十幾年內(nèi)，不少學(xué)者采用此技術(shù)結(jié)合不同的運動方式和運動強度對運動過程中中樞生化物質(zhì)的代謝從不同角度進行了大量研究工作，極大地推進了運動的神經(jīng)生物機制研究的進程。微透析技術(shù)實驗可用于被限制動物或麻醉的活體上，也可以用于自由活動的清醒研究對象，由于微透析裝置對待測組織的相對固定性要求較高，故其應(yīng)用于腦組織的研究最為多見。目前運用微透析技術(shù)對運動的研究主要集中于運動與神經(jīng)遞質(zhì)方面。

3.1 神經(jīng)系統(tǒng)研究

早期的研究多集中于對運動過程中大腦內(nèi)不同部位神經(jīng)遞質(zhì)水平的觀察，后來研究者擴大了應(yīng)用的部位和研究的對象，同時還聯(lián)合進行電生理、蛋白質(zhì)等指標(biāo)的檢測。日本學(xué)者Hattori等1993年首次將該技術(shù)應(yīng)用于運動與腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的研究，發(fā)現(xiàn)跑臺運動能顯著增加大鼠紋狀體多巴胺（dopamine，DA）及其代謝產(chǎn)物多巴（dioxyphenylalanine，Dopa）的含量［5］。隨后Hattori等采用微透析技術(shù)對此進行進一步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紋狀體DA變化對于運動應(yīng)激存在閾強度，當(dāng)運動強度達到閾上強度時，紋狀體DA釋放就增加［6］。這樣的研究結(jié)果充分體現(xiàn)了微透析技術(shù)對于研究運動的優(yōu)越性，充分體現(xiàn)了微透析采樣檢測的準(zhǔn)確、動態(tài)、在體、實時的特點。比利時學(xué)者Meeusen采用微透析技術(shù)對運動與腦神經(jīng)遞質(zhì)代謝進行了長期而系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)運動過程中神經(jīng)遞質(zhì)之間存在著相互調(diào)節(jié)的作用［7］，長期的運動訓(xùn)練能導(dǎo)致紋狀體神經(jīng)遞質(zhì)基礎(chǔ)活性降低，但仍維持必要的活性以應(yīng)對劇烈運動的需要［8］。Gomez等通過微透析的實驗證實短時間劇烈跑臺運動可導(dǎo)致海馬與皮層5-羥色胺（serotonin，5-HT）濃度顯著增加，并且在恢復(fù)期的前30分鐘達到峰值，此后皮層5-HT水平快速下降，但海馬區(qū)的5-HT并沒有立即恢復(fù)，仍處于峰值水平。在運動過程中細(xì)胞外液5-羥吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA）水平的變化與5-HT變化趨勢相似，但在恢復(fù)期2個腦區(qū)之間沒有差異，結(jié)果提示劇烈的運動能夠?qū)е麓竽X5-HT釋放增加，但在恢復(fù)期卻存在部位差異［9］。Kurosawa等采用微透析與跑臺運動結(jié)合的方法，對大鼠在2.3m/min的跑臺運動過程中大腦皮層頂葉乙酰膽堿（Acetylcholine，Ach）、 去 甲 腎 上 腺 素 （Norepinephrine，NE）和5-HT水平的代謝進行了觀察，發(fā)現(xiàn)5分鐘的運動即可使上述三種神經(jīng)遞質(zhì)含量均顯著增加［10］。Pagliari等發(fā)現(xiàn)60分鐘的跑臺運動顯著增加腦內(nèi)NE的濃度，且運動時間延長至2小時時NE能夠更進一步地增加，機體自身的健康狀況亦會影響NE的應(yīng)答反應(yīng)，長期的運動訓(xùn)練可以有效降低腦內(nèi)NE對于運動的應(yīng)激反應(yīng)［11］。另外一項微透析的實驗研究發(fā)現(xiàn)大鼠在清醒狀態(tài)或者運動初期時腦內(nèi)細(xì)胞外液中Ach的釋放量顯著增加［12］。國內(nèi)學(xué)者喬德才等通過微透析結(jié)合毛細(xì)管電泳—激光誘導(dǎo)技術(shù)，在運動性中樞疲勞方面做了長期而大量的研究工作，發(fā)現(xiàn)在力竭運動早期谷氨酸 （aminoglutaric acid，Glu）和DA等興奮性神經(jīng)遞質(zhì)作用占優(yōu)勢，而運動后期則以5-HT和γ-氨基丁酸 （Gamma-aminobutyric acid，GABA）的抑制作用占優(yōu)勢，且力竭運動引起的紋狀體細(xì)胞外液中神經(jīng)遞質(zhì)濃度的變化需要較長時間的恢復(fù)［13，14］。其還借助于微透析和皮層腦電儀來研究乳酸在運動性疲勞形成中的作用，發(fā)現(xiàn)在力竭運動初期腦內(nèi)乳酸升高，在運動后期及恢復(fù)期都顯著降低，此外，人為將腦內(nèi)乳酸攝取和吸收阻滯后，皮層腦電功率譜總功率迅速下降。根據(jù)以上現(xiàn)象，其推斷乳酸是運動狀態(tài)下腦神經(jīng)元主要依賴的能量底物［15］。他們還將微透析技術(shù)與微電極胞外記錄技術(shù)聯(lián)用以研究神經(jīng)遞質(zhì)對神經(jīng)元電活動的調(diào)節(jié)作用，為更深入理解中樞疲勞的機制提供了新的方向［16］。

一些學(xué)者還通過微透析技術(shù)對體溫調(diào)節(jié)的機制進行了深入研究。Hasegawa等通過微透析技術(shù)觀察跑臺運動大鼠體溫調(diào)節(jié)中樞的神經(jīng)遞質(zhì)水平變化，發(fā)現(xiàn)在體溫變化過程中視前區(qū)-下丘腦前部的5-HT水平無明顯變化，而進一步的研究則表明在運動強度改變而造成體溫升降的同時，體溫調(diào)節(jié)中樞部位的NE和DA水平相應(yīng)升高和降低。根據(jù)研究結(jié)果，其認(rèn)為體溫的調(diào)節(jié)受兒茶酚胺能神經(jīng)遞質(zhì)（DA，NE）的影響而與5-HT無關(guān)［17，18］。

法國學(xué)者Gerin等用微透析技術(shù)對運動過程中中樞脊髓內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)進行了較為系統(tǒng)的研究，他們在大鼠腰椎脊髓內(nèi)植入探針，觀察運動對脊髓內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外液5-HT的釋放在持續(xù)60分鐘的運動中沒有升高［19］。而在其后續(xù)的研究中將微透析電極長期植入脊索腹側(cè)纖維，觀察到5-HT、DA及其代謝產(chǎn)物在運動中均顯著增加［20］。為了更進一步揭示運動與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)代謝之間的關(guān)系，Gerin等又測量了成年大鼠在靜息、長時間的跑臺運動以及運動恢復(fù)期脊髓前角細(xì)胞外液中5-HT和5-HIAA、DA和Dopa的變化特征，發(fā)現(xiàn)與安靜狀態(tài)的5-HT和5-HIAA水平相比，運動過程中兩種物質(zhì)輕微降低，但在運動后顯著降低。而DA和Dopa在運動中出現(xiàn)輕微的上升，之后出現(xiàn)下降趨勢［21］。Gerin等綜合一系列的微透析實驗研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)運動過程中脊髓腹側(cè)角存在復(fù)雜的單胺類物質(zhì)釋放的調(diào)節(jié)機制。

微透析技術(shù)也被應(yīng)用于運動與腦能量代謝方面的研究。Bland等研究了運動應(yīng)激對大鼠海馬、紋狀體以及感覺運動區(qū)細(xì)胞外液葡萄糖濃度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)運動可導(dǎo)致這些腦區(qū)透析液中葡萄糖水平明顯升高［22］。將微透析采樣技術(shù)與其他的在線測量技術(shù)聯(lián)用，可以更好地從不同層次揭示腦生理功能的變化機制。法國學(xué)者Bequet等將質(zhì)子核磁共振光譜檢測法與微透析相結(jié)合來觀察大腦細(xì)胞外液與全腦葡萄糖在運動過程中的代謝變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外周與中樞葡萄糖變化存在密切聯(lián)系，運動過程中盡管外周環(huán)境血糖水平較低，但運動同樣能增加大腦細(xì)胞外液中葡萄糖的水平，這一現(xiàn)象提示在運動過程中中樞葡萄糖代謝存在一種特殊的調(diào)節(jié)機制［23］。

3.2 運動系統(tǒng)研究

微透析技術(shù)在運動中骨骼肌生理活性物質(zhì)、離子濃度及代謝變化的檢測中應(yīng)用頗廣。應(yīng)用微透析技術(shù)研究運動引起的血流、肌蛋白代謝和神經(jīng)遞質(zhì)變化的機制取得了一系列進展。Lott等［24］發(fā)現(xiàn)，一方面，在節(jié)律性運動中，肌肉間隙的腺苷、ATP、鉀離子濃度的變化是導(dǎo)致運動性充血發(fā)生的主要原因；在低強度的運動中，緩激肽也起到了同樣的作用;氫離子的作用仍有待進一步研究來確定；磷酸鹽、乳酸、一氧化氮和前列環(huán)素則在引起運動后充血的發(fā)生中起到一定的作用。另一方面，肌間隙中的ATP和磷酸鹽能夠引起升壓反射，而間隙中的腺苷、乳酸、氫離子、鉀離子則未起到明顯的作用。同時，該學(xué)者也指出，受制于目前微透析技術(shù)水平的限制，還不能確定上述骨骼肌間隙的物質(zhì)代謝在運動中是同時進行、互相協(xié)同還是先后發(fā)生而最終產(chǎn)生調(diào)節(jié)血流作用。Mortensen等［25］根據(jù)微透析采樣技術(shù)在人體中的研究發(fā)現(xiàn)，在運動中，腺苷能夠通過刺激前列腺素和一氧化氮的合成來提高大腿肌肉的血流供應(yīng)。

Haus等［26］將微透析探針插入5名年輕男性受試者股外側(cè)肌中，研究有氧運動后肌纖維蛋白的代謝變化，發(fā)現(xiàn)肌原纖維的蛋白水解水平在進行劇烈的有氧運動后的3天內(nèi)不變，但運動刺激引起的合成作用更強。研究者從而得出了以下結(jié)論：肌纖維蛋白的分解與合成這兩個過程是相互關(guān)聯(lián)的，蛋白水解為肌原纖維的合成提供了氨基酸，長期的有氧運動不會導(dǎo)致肌纖維蛋白質(zhì)的量增加。

Li等［27］使用微透析技術(shù)結(jié)合高效液相色譜法研究了雄性大鼠運動前后小腿三頭肌中ATP和NE的濃度變化，發(fā)現(xiàn)運動后ATP和NE的濃度都有所提高，升高幅度與運動強度有關(guān)，而且兩者的升高呈線性關(guān)系。此外，NE濃度在運動的肢體中升高的幅度遠(yuǎn)高于非運動肢體，從而表明這并非是一種反射性的作用。而直接在對照肢體的血管中注入ATP并不能引起NE的升高。在肢體血管中注入嘌呤2X受體拮抗劑，運動后肢體肌肉中NE濃度的升高幅度顯著降低。根據(jù)以上結(jié)果，研究者證實骨骼肌運動后產(chǎn)生的ATP刺激交感神經(jīng)的嘌呤2X受體，從而促進了肌間隙中NE濃度的升高這一假設(shè)。

3.3 能量代謝研究

作為運動醫(yī)學(xué)研究熱點之一，能量代謝的研究早在1994年就開始陸續(xù)引入微透析技術(shù)，尤其是在運動對葡萄糖、脂肪代謝的影響方面［28］。

Ormsbee等［29］采用微透析技術(shù)研究抗阻運動對脂代謝的影響。在這項研究中，微透析裝置被分別置于10名肥胖受試者（BMI：36.2±2.7）和10名偏瘦受試者（BMI：20.9±0.6）的腹部皮下脂肪組織中，通過阻抗運動前后分析結(jié)果的對比發(fā)現(xiàn)：運動后，兩組的腹部脂肪分解水平均明顯增高，但偏瘦組效果更明顯（皮下脂肪間隙中的甘油濃度在運動中升高的幅度明顯高于肥胖組）。肥胖組血漿中的生長激素水平低于偏瘦組可能是肥胖者脂肪分解受抑制的原因。

雖然微透析技術(shù)在研究碳水化合物代謝及脂肪分解的應(yīng)用方面已經(jīng)非常普遍，但該技術(shù)無法分清所研究的代謝產(chǎn)物究竟是來自研究部位的代謝還是由其他部位轉(zhuǎn)運而來。 2007年，Gustafsson等［30］將C13標(biāo)示過的葡萄糖通過微透析探針?biāo)腿敫共科は轮窘M織中，然后通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析運動過程中脂肪的代謝情況。研究結(jié)果證明運動狀態(tài)下脂肪組織中乳酸的增加并非僅由于局部脂肪分解所造成，更大程度上是由其他組織轉(zhuǎn)運而來的。同時該研究也證實采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記法配合微透析技術(shù)在能量代謝研究中的可行性。

一些學(xué)者借助微透析技術(shù)，在肌腱的生理及病理研究方面取得了成果。Langberg等［31］通過微透析探針監(jiān)測運動后跟腱周圍膠原前蛋白（carboxyterminal propeptide of type I collagen，PICP）和膠原降解物 （C-OOH terminal telopeptide of type I collagen，ICTP）等，發(fā)現(xiàn)運動后72小時肌腱周圍的PICP和ICTP均升高了3倍，提示運動能夠增加肌腱周圍I型膠原的合成。 2011年，Andersen等［32］通過微透析技術(shù)觀察14名男性健康受試者肌腱周圍組織中膠原的轉(zhuǎn)化標(biāo)志物procollagen type I NH2-terminal propeptide（PINP）和ICTP，來研究肌腱的合成代謝。在運動組和對照組中分別灌注白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6），結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組中PINP合成均顯著升高，從而證實了在正常人的肌腱中，IL-6能夠促進膠原的合成。

微透析技術(shù)還被用于監(jiān)測人體內(nèi)物質(zhì)與汗腺分泌及體溫調(diào)節(jié)的關(guān)系。Colberg等［33］通過對足背部位的微透析研究發(fā)現(xiàn)，長期的有氧運動（6個月）能夠通過一氧化氮（NO）來增大皮膚的血流灌注量。有學(xué)者［34］將微透析探針置入10名受試者（5男5女）前臂后側(cè)無汗毛部位的皮下，在熱環(huán)境運動時，試驗部位灌注一氧化氮合酶（nitricoxide synthase，NOS）非選擇性抑制劑，對照部位灌注0.9%鹽水，同時監(jiān)測局部出汗率和體溫變化情況。結(jié)果表明，皮膚或汗腺周圍代謝產(chǎn)生的NO能夠增加局部的出汗率和皮下擴張的程度。

4 微透析技術(shù)在運動醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用展望

微透析與高效毛細(xì)管電泳 （High performance capillary electrophoresis，HPCE）以及高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC） 等分離技術(shù)聯(lián)用，再結(jié)合高靈敏度的檢測技術(shù)，使得微透析技術(shù)在活體狀態(tài)下檢測組織、器官的微量物質(zhì)的變化方面具有其他方法所無可比擬的優(yōu)勢。HPLC具有較高的分離和檢測效率，而HPCE靈敏度高且對預(yù)處理的要求低，目前已經(jīng)越來越多地得到應(yīng)用［35，36］。檢測技術(shù)方面，微芯片電泳和生物傳感器開始出現(xiàn)在一些研究之中，前者靈敏度高，并且可以與檢測器整合從而實現(xiàn)設(shè)備小型化，而后者可特異性地與待測物反應(yīng)，從而實現(xiàn)適時分析測定［37-39］。此外，透析裝置的改進，使得對檢測動物和人的要求和限制大大降低［40］。以上新技術(shù)的引入，不斷地擴大微透析技術(shù)的應(yīng)用范圍，也幫助了具體研究的進一步深入，為運動醫(yī)學(xué)的發(fā)展和進步提供了強有力的工具。

雖然微透析技術(shù)在研究運動與中樞神經(jīng)遞質(zhì)代謝方面取得了不少研究成果，但不同學(xué)者的研究結(jié)果并不一致。運動過程中，腦內(nèi)不同腦區(qū)、核團在腦功能活動過程中所起的作用是有差異的，因此，神經(jīng)遞質(zhì)代謝或能量代謝在運動過程中也應(yīng)存在較大的區(qū)域性差異，這可能是造成目前研究者們所得出研究結(jié)論有差異的主要原因。因此，不同腦區(qū)在某一生理活動過程中的同步檢測將更有助于揭示腦復(fù)雜的行為調(diào)控機制。所以，本文認(rèn)為腦內(nèi)多探針植入不同核團、腦區(qū)同步微透析的研究模式將會成為以后微透析技術(shù)的發(fā)展趨勢，當(dāng)然，這可能需要微透析探針體積更小且具有更高的回收率。

運動性疲勞是運動生理學(xué)研究者們長期關(guān)注的熱點問題，目前在運動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域所開展的微透析實驗研究也多圍繞運動性疲勞進行。運動性疲勞是一個外周和中樞協(xié)同交互作用的復(fù)雜過程，中樞與外周各系統(tǒng)之間存在復(fù)雜的相互調(diào)控機制，而在這方面的研究仍非常有限。目前，在藥動學(xué)研究中已經(jīng)有學(xué)者將腦、脊髓以及外周血液等同步進行微透析的研究［41］。如果能在中樞與外周不同組織器官進行微透析同步檢測，將中樞與外周有機結(jié)合起來，對于從多層次揭示運動性疲勞的機制將非常有利，例如對腦、血液系統(tǒng)、骨骼肌系統(tǒng)的生物活性物質(zhì)的代謝情況進行同步檢測。運動本身給這樣的研究方法造成了很大的困難，但隨著微透析采樣技術(shù)的不斷進步與發(fā)展，這樣的研究設(shè)想可能會逐步實現(xiàn)。另外，微透析同其它一些活體的研究手段如腦電圖掃描（electrocardiogram，EEG）、 功能性磁共振成像（functional MRI，fMRI）、正電子斷層掃描（Positron Emission Tomography，PET）等技術(shù)的不斷結(jié)合，將使得微透析技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用。

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