大鼠腦挫傷后腦與其他器官組織中TNF-α表達的比較

嚴(yán) 治，孫小麗，胡玉蓮，劉 敏

（1.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2.重慶市公安局物證鑒定中心，重慶 410041）

大鼠腦挫傷后腦與其他器官組織中TNF-α表達的比較

嚴(yán) 治1，2，孫小麗1，胡玉蓮1，劉 敏1

（1.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2.重慶市公安局物證鑒定中心，重慶 410041）

目的 比較大鼠腦挫傷組織及其他器官組織中腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表達的差異，期望為法醫(yī)病理學(xué)腦挫傷的診斷以及損傷時間的判斷提供理論依據(jù)。 方法 對45例SD大鼠腦挫傷后腦組織及心、肝、脾、肺、腎等器官組織進行TNF-α免疫組織化學(xué)染色，觀察腦挫傷對不同器官中TNF-α表達水平的影響。 結(jié)果 腦損傷后1h，TNF-α在腦組織即有表達，分別在6h及3d出現(xiàn)兩次高峰，7d表達減弱，但仍明顯高于正常。心、肝、脾、肺、腎組織中TNF-α在顱腦損傷后1h也有表達，隨損傷時間延長，陽性細胞逐漸增多，3d最高，7d雖有所下降，但仍顯著高于正常。 結(jié)論 在研究腦損傷局部變化的同時，也可研究其他器官組織的相應(yīng)變化，有助于腦損傷診斷及損傷時間推斷。

法醫(yī)病理學(xué)；腦損傷；腫瘤壞死因子α；大鼠

腦損傷在法醫(yī)學(xué)實踐中極為常見，有關(guān)腦損傷的研究較多，但多集中在顱腦本身[1-2]。機體作為一個有機整體，顱腦損傷必然會導(dǎo)致其他組織的變化，有文獻[3]報道創(chuàng)傷性腦損傷不僅可以引起腦水腫、炎性反應(yīng)和遲發(fā)性神經(jīng)細胞死亡等變化，還可引起其他相關(guān)器官發(fā)生功能障礙。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是腦感染、創(chuàng)傷、缺血、缺氧等過程中的重要因子，本研究在建立大鼠腦挫傷動物模型的基礎(chǔ)上，研究腦組織挫傷區(qū)以及心、肝、脾、肺、腎等器官組織中TNF-α表達的變化，并比較腦組織及其他器官組織表達的差異，期望為腦挫傷的法醫(yī)病理診斷、損傷時間的判斷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

兔抗大鼠TNF-α多克隆抗體、即用型SABC免疫組織化學(xué)試劑盒（包括5%BSA封閉液、生物素化羊抗兔IgG、ABC復(fù)合物、DAB顯色試劑等），均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動物分組及模型的建立

健康SD大鼠45只（四川達州實驗動物中心提供），雌雄不限，體質(zhì)量160～220g，隨機分為正常對照組（5只）、假手術(shù)組（5只）、實驗組（35只）。實驗組建立大鼠腦挫傷模型后，按照顱腦損傷后處死時間不同又分為1、3、6、12h和1、3、7d共7個亞組，每個亞組5只大鼠。

[4-7]的方法建立大鼠腦挫傷模型：大鼠麻醉后除去頭皮處鼠毛，用手術(shù)刀切開大鼠頭部中線皮膚，分離皮下組織筋膜，暴露左側(cè)人字縫與冠狀縫之間的顱骨。用質(zhì)量為25g砝碼以自由落體運動打擊大鼠左側(cè)頂部顱骨，打擊高度為1.6m。砝碼頭穿透顱骨，入腦2mm，造成大鼠腦挫傷。在腦挫傷模型建立后分別在1、3、6、12h和1、3、7d斷頸處死，迅速取出腦、心、肝、脾、肺、腎，用4%多聚甲醛溶液固定2d后，分別在腦挫傷區(qū)及其他器官取材，石蠟包埋、切片。假手術(shù)組麻醉及手術(shù)步驟與實驗組相同，但不用砝碼打擊動物頭部。正常對照組及假手術(shù)組均在相應(yīng)部位進行取材作為對照。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

常規(guī)石蠟切片，按試劑盒說明書進行免疫組織化學(xué)染色，并另取同樣切片進行HE染色。陰性對照以PBS取代一抗。

1.4 圖像分析及統(tǒng)計學(xué)處理

在光鏡下進行觀察，腦組織切片分別在左側(cè)挫傷區(qū)、雙側(cè)大腦皮質(zhì)區(qū)、雙側(cè)海馬區(qū)隨機選取5個高倍視野，用Image-Pro Plus圖像分析軟件測定5個視野內(nèi)腦組織平均陽性信號積分光密度（integrated optical density，IOD）。其他器官組織每張切片隨機選取5個高倍視野，測定5個視野內(nèi)平均陽性信號IOD。數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 11.5軟件包進行單因素方差分析、t檢驗，數(shù)據(jù)用±s表示。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 各器官組織常規(guī)HE染色

正常對照組及假手術(shù)組腦組織及其他器官組織均無明顯異常改變。

實驗組大鼠傷后1h，損傷局部腦組織片狀出血，蛛網(wǎng)膜下腔出血、腦血管充血擴張、腦組織水腫；傷后3h，挫傷灶邊緣見小膠質(zhì)細胞增多，挫傷灶邊緣及海馬區(qū)神經(jīng)元腫脹，體積增大，核膜尚清，核仁深染偏位或消失；傷后6h，腦組織水腫更加明顯；傷后12h，挫傷灶遠離部位及海馬區(qū)部分神經(jīng)元腫脹，核膜不清，個別核溶解消失；傷后1d，挫傷灶周圍見炎癥反應(yīng)；傷后3d，神經(jīng)細胞壞死更明顯；傷后7d，挫傷灶邊緣見明顯炎癥反應(yīng)。

實驗組大鼠傷后1 h，肺組織部分肺小動脈及毛細血管淤血；傷后1d，肺間質(zhì)毛細血管充血明顯，部分肺泡間隔增寬；傷后3 d上述改變更加顯著，并見部分肺泡內(nèi)充滿紅染均質(zhì)液體，部分肺泡萎陷；傷后7d，水腫減輕，肺泡間隔仍寬，細胞數(shù)量明顯增多。心肌各時間段僅見間質(zhì)淤血改變。肝竇增寬、充血擴張。腎、脾各組僅見間質(zhì)血管充血。

2.2 各器官組織TNF-α染色

2.2.1 大鼠腦組織TNF-α染色

正常對照組及假手術(shù)組大鼠腦組織TNF-α染色陽性信號無表達或僅見個別細胞表達（圖1A）。實驗組傷后1h，在挫傷灶周圍、大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)均見呈彌散性分布的陽性染色的神經(jīng)細胞和膠質(zhì)細胞，細小的陽性棕褐色顆粒均勻分布于神經(jīng)細胞和膠質(zhì)細胞質(zhì)內(nèi)，挫傷灶周圍及海馬區(qū)域陽性細胞數(shù)較多；傷后3h，陽性細胞數(shù)量稍增多，細胞內(nèi)棕褐色著色略微增強；傷后6h，陽性細胞數(shù)明顯增多，胞漿陽性顆粒著色較深，達到第一高峰（圖1B）；至傷后1d，陽性細胞數(shù)量減少，胞核和胞漿著色變淺；傷后3d，胞漿陽性顆粒著色較深，達到第二高峰（圖1C）；傷后7d，陽性細胞數(shù)量減少，胞漿著色變淺，但仍高于正常水平。各實驗組與正常對照組及假手術(shù)組相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

圖1 大鼠腦組織TNF-α染色結(jié)果

表1 大鼠各組織TNF-α的陽性信號IOD值 （n=5，±s）

表1 大鼠各組織TNF-α的陽性信號IOD值 （n=5，±s）

組別 腦 心 肝 脾 肺 腎正常對照 138.4±62.9 112.7±52.4 128.4±52.6 242.9±69.7 355.6±74.5 135.8±74.1假手術(shù) 142.5±72.6 105.6±53.5 130.5±64.6 253.7±50.6 345.8±84.6 142.2±84.4傷后1h 4246.3±553.6 935.6±184.8 1292.1±204.5 1112.8±256.4 3846.3±523.6 2673.4±289.5傷后3h 8776.8±532.6 1525.4±187.3 1675.7±172.4 1578.6±174.3 5536.8±344.7 4895.7±547.3傷后6h 12396.4±1032.4 1884.9±179.5 2078.5±177.4 2182.4±165.4 7851.6±593.6 5687.5±586.2傷后12h 10882.3±642.7 2948.3±178.2 3967.8±172.7 3896.5±228.6 9021.9±712.7 8536.2±645.8傷后1d 9076.9±736.8 3269.3±214.6 4226.3±198.6 4357.2±189.5 11329.1±832.5 10238.8±814.3傷后3d 16835.8±977.4 4253.6±356.7 7342.6±270.4 7678.6±307.8 17826.7±896.4 16834.9±896.6傷后7d 3903.4±452.7 925.4±147.5 1075.7±194.6 1078.6±177.8 2836.8±284.2 1983.8±545.3

2.2.2 大鼠心、肝、脾、肺、腎組織TNF-α染色

正常對照組及假手術(shù)組大鼠心、肝、脾、肺、腎組織在各時間段內(nèi)TNF-α基本不表達或個別細胞呈弱陽性表達（圖2A～B）。實驗組傷后1 h，肺、腎組織TNF-α免疫組織化學(xué)染色陽性細胞開始增多，主要分布在肺細支氣管上皮細胞及腎髓質(zhì)；心臟陽性細胞為心肌細胞，表達較弱；肝表達較弱，陽性細胞主要為肝細胞；脾在紅白髓中呈散在分布，表達亦較弱。傷后3 h，肺內(nèi)支氣管上皮細胞染色略加深，陽性細胞稍增多，在肺泡間隔及肺泡上皮細胞見少量散在分布的TNF-α陽性細胞；腎髓質(zhì)內(nèi)陽性細胞稍增多，染色略加深，個別腎小球見TNF-α陽性細胞；心、肝、脾組織內(nèi)陽性細胞數(shù)量稍增多，細胞內(nèi)棕褐色著色略微增強。傷后12 h，肺細支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞及肺泡間隔內(nèi)陽性顆粒著色更深，陽性細胞數(shù)明顯增多；腎髓質(zhì)內(nèi)陽性細胞明顯增多，胞漿陽性顆粒著色更深，部分腎小球內(nèi)陽性顆粒著色亦增多；心、肝、脾陽性細胞數(shù)量增多，細胞內(nèi)棕褐色著色增強。傷后3 d，肺、腎、肝、脾、心組織內(nèi)陽性細胞數(shù)量達高峰，著色最深（圖2C～D）。傷后7d，陽性細胞數(shù)量減少，胞漿著色變淺，但仍明顯高于正常。各實驗組與正常對照組及假手術(shù)組組織中TNF-α陽性信號IOD值相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

圖2 大鼠肺、腎組織TNF-α染色結(jié)果 ABC×200

3 討 論

3.1 大鼠心、肝、脾、肺、腎組織中TNF-α的表達規(guī)律

本研究發(fā)現(xiàn)，顱腦損傷后，肺內(nèi)TNF-α表達較強，傷后1h，細支氣管上皮細胞胞漿內(nèi)開始表達，傷后3h肺泡上皮細胞及肺泡間隔少量TNF-α表達，傷后12 h表達增強，傷后3 d表達達高峰；傷后7 d，表達減弱，但明顯高于正常。腎組織中表達亦較強，傷后1h，腎小管上皮細胞就有表達，傷后3h，TNF-α在個別腎小球內(nèi)有表達，傷后12h，表達增強，傷后3d，表達達高峰；傷后7 d，表達減弱，但仍明顯高于正常。心、肝、脾內(nèi)TNF-α表達較弱，傷后1h，在心肌細胞、肝細胞及脾紅白髓內(nèi)TNF-α開始表達；傷后12h，表達逐漸增強；3 d達高峰，傷后7 d表達減弱，但仍明顯高于正常。本研究結(jié)果表明在大鼠腦挫傷后，心、肝、脾、肺、腎組織中均有TNF-α表達，并呈現(xiàn)一定規(guī)律性變化，且均在3d左右達高峰。

3.2 顱腦損傷后腦組織TNF-α表達規(guī)律

Fan等[8]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦液壓沖擊傷后，TNF-α mRNA在腦損傷早期（傷后1h）即可被檢測到，TNF-α mRNA不只在腦損傷側(cè)表達，而且在非損傷側(cè)半球同樣表達。Shohami等[9]采用腦液壓沖擊傷后，腦組織中TNF-α的表達在損傷同側(cè)8h達到最大，一直延續(xù)到傷后18h，表達開始下降。陳成春等[10]研究發(fā)現(xiàn)，腦挫傷后腦組織中TNF-α的合成在損傷2h后明顯升高，6h達到最高后，迅速下降，至傷后1d基本恢復(fù)正常水平，傷后3 d其合成水平再次升高，至第5天達到高峰后緩慢下降，傷后10d恢復(fù)至傷前水平。本實驗研究發(fā)現(xiàn)大鼠腦挫傷后1h，就可以檢測到TNF-α的表達，之后在6h及3d出現(xiàn)兩次峰值，這與陳成春等研究基本一致。Soares等[11]發(fā)現(xiàn)外傷性腦損傷后18～24h，多型核中性白細胞在腦內(nèi)聚集。Dubravec等[12]通過體外細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)血液中的多型核中性白細胞能夠產(chǎn)生TNF-α mRNA和分泌TNF-α蛋白。提示在3d左右發(fā)生TNF-α表達的第二個高峰，可能與此有關(guān)。

3.3 大鼠腦組織及其他器官組織TNF-α染色結(jié)果比較

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦挫傷后1 h，在腦挫傷區(qū)、雙側(cè)海馬及雙側(cè)大腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細胞及膠質(zhì)細胞胞漿內(nèi)就可以檢測到TNF-α的表達，分別在6h及3d出現(xiàn)兩次高峰，心、肝、脾、肺、腎組織在顱腦損傷后1h就有表達，第3天最高，7d雖有所下降，但仍顯著高于正常。說明顱腦損傷后腦及其他器官組織中均有TNF-α表達，但腦內(nèi)與其他器官組織表達峰值時間存在一定差異。本研究表明對于顱腦損傷者，除可研究腦損傷局部組織外，亦可同時研究其他器官組織，有助于腦損傷診斷及腦損傷時間推斷。

參考文獻：

[1] 劉輝，陳俊拋.腫瘤壞死因子-α與缺血性腦損傷[J].國外醫(yī)學(xué)腦血管疾病分冊，1998，6（5）：263-266.

[2] Liu T，Clark RK，McDonnell PC，et al.Tumor necrosis factor-alpha expression in ischemic neurons[J]. Stroke，1994，25（7）：1481-1488.

[3] Gong C，Hoff JT，Keep RF.Acute inflammatory reaction following experimental intracerebral hemorrhage in rat[J].Brain Res，2000，871（1）：57-65.

[4] Cernak I.Animal models of head trauma[J].NeuroRx，2005，2（3）：410-422.

[5] Marmarou A，F(xiàn)oda MA，van den Brink W，et al.A new model of diffuse brain injury in rats.PartⅠ：Pathophysiology and biomechanics[J].J Neurosurg，1994，80（2）：291-300.

[6] Foda MA，Marmarou A.A new model of diffuse brain injury in rats.PartⅡ：Morphological characterization[J]. J Neurosurg，1994，80（2）：300-313.

[7] 陳建良，呂文，郭偉，等.大鼠腦損傷動物模型研制方法的探討[J].中華實驗外科雜志，2003，20（3）：281-283.

[8] Fan L，Young PR，Barone FC，et al.Experimental brain injury induces differential expression of tumor necrosis factor-alpha mRNA in the CNS[J].Brain Res Mol Brain Res，1996，36（2）：287-291.

[9] Shohami E，Novikov M，Bass R，et al.Closed head injury triggers early production of TNF alpha and IL-6 by brain tissue[J].J Cereb Blood Flow Metab，1994，14（4）：615-619.

[10]陳成春，黃濤，金建華.腦挫傷后腫瘤壞死因子α表達水平變化的實驗研究[J].中國臨床解剖學(xué)雜志，2006，24（1）：90-92.

[11]Soares HD，Hicks RR，Smith D，et al.Inflammatory leukocytic recruitment and diffuse neuronal degeneration are separate pathological processes resulting from traumatic brain injury[J].J Neurosci，1995，15（12）：8223-8233.

[12]Dubravec DB，Spriggs DR，Mannick JA，et al.Circulating human peripheral blood granulocytes synthesize and secrete tumor necrosis factor alpha[J].Proc Natl Acad Sci U S A，1990，87（17）：6758-6761.

2011-01-17）

（本文編輯：劉寧國）

Different Expression of TNF-α in Brain and Peripheral Organs after Cerebral Contusion of Rats

YAN Zhi1,2,SUN Xiao-li1,HU Yu-lian1,LIU Min1
（1.West China School of Basic Medicine and Forensic Medicine,Sichuan University,Chengdu 610041,China; 2.Institute of Forensic Science,Chongqing Public Security Bureau,Chongqing 410041,China）

Objective To compare the expression of tumor necrosis factor-α（TNF-α）between brain and peripheral organs after cerebral contusion in order to provide the scientific theoretical basis for forensic pathological diagnosis and wound age estimation.Methods Brain and peripheral organs including heart, liver,spleen,lung,kidney tissues of 45 SD rats after the cerebral contusion were obtained and TNF-α of these tissues were analyzed with immunohistochemistry methods.Results TNF-α was detected at 1 h in brain,reaching maximum at 6h and 3d after the cerebral contusion,and then decreased but still kept at high expression level at 7d.TNF-α was detected at 1h after the cerebral contusion in heart,liver,spleen, lung and kidney tissues.The number of cells expressing TNF-α increased gradually,reaching maximum at 3 d after the contusion of brain,and then decreased but still kept at high expression level at 7 d.Conclusion Besides the change of cerebral contusion,this study considered both the brain and peripheral organs.It is helpful for forensic pathological diagnosis and wound age estimation after contusion of brain.

forensic pathology;brain injuries;tumor necrosis factor-α;rats

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2012.04.005

1004-5619（2012）04-0261-04

嚴(yán)治（1981—），男，四川巴中人，碩士研究生，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究；E-mail：yanzhiyx2000@163.com

劉敏，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)科研、教學(xué)工作；E-mail：min8liu@hotmail.com